硫化氫對腎血管性高血壓大鼠動脈舒張功能的調節作用

潘國聘，張小毅，李東亮，趙紅崗，劉瑞麗

(1.新鄉醫學院藥學院藥理學教研室；2.新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室,河南 新鄉　453003)

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硫化氫對腎血管性高血壓大鼠動脈舒張功能的調節作用

潘國聘1，張小毅1，李東亮2，趙紅崗2，劉瑞麗1

(1.新鄉醫學院藥學院藥理學教研室；2.新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室,河南 新鄉453003)

目的探討硫化氫(H2S)對腎血管性高血壓模型大鼠血壓及頸總動脈血管舒張功能的影響。方法采用“兩腎一夾(2K1C)”法建立腎血管性高血壓模型。大鼠隨機分為假手術組、雙腎一夾(2K1C)模型組、2K1C+NaHS(H2S供體)組及PPG(H2S代謝酶抑制劑)組。術前及術后每周測量1次大鼠尾動脈收縮壓(SBP)。測定頸總動脈血管形態學指標(血管外周、壁厚、壁厚與外周徑的比值)，觀察頸總動脈的ACh介導的內皮依賴性舒張作用；免疫組化檢測頸總動脈一氧化氮合成酶(eNOS)、內皮素-1(ET-1)的表達。結果PPG組及2K1C組大鼠尾動脈血壓與sham組比較明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，2K1C+NaHS組血壓明顯降低，大鼠頸總動脈壁厚外徑比減小，頸總動脈對ACh介導的內皮依賴性舒張效應增強，頸總動脈一氧化氮合成酶(eNOS)含量升高、ET-1含量降低。結論給予外源性的硫化氫供體可降低血壓，緩解腎血管性高血壓的形成，其作用可能與改善頸總動脈血管功能有關。

硫化氫；腎血管性高血壓；兩腎一夾；內皮依賴性；eNOS；ET-1

腎血管性高血壓(renovascular hypertension, RVH)是一種常見的繼發性高血壓，其發生的機制尚未完全明了。H2S是繼一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后被發現的第3種內源性氣體信號分子[1-2]，在各系統中發揮著重要的生理學及病理生理學作用[3]。研究表明，內源性H2S在維持正常血壓和保持血管舒張功能方面非常重要，其內源生成減少也參與高血壓等多種疾病的病理生理過程[4]。那么，外源性給予H2S能否降低腎血管性高血壓大鼠的動脈血壓，以及H2S對腎血管性高血壓大鼠血管舒張功能的調節作用如何呢？本研究以2K1C法建立腎血管性高血壓大鼠模型，觀察H2S對腎性高血壓大鼠血壓及血管功能的調節作用并探討可能的機制。

1　材料與方法

1.1動物健康4～5月齡清潔級♂ Wistar大鼠，體質量為200～300 g，常規大鼠飼料及凈化自來水飼養。待大鼠適應環境, 血壓穩定后, 開始正式實驗。

1.2主要試劑與藥品硫氫化鈉(NaHS)、乙酰膽堿(ACh)，購自sigma公司； eNOS、ET-1抗體，由Abcam公司提供；山羊抗兔多克隆抗體(二抗)由Proteintech公司提供；NaHS及PPG溶液于實驗當天新鮮配制。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備與分組根據文獻報道[5]，制備兩腎一夾(2K1C)腎血管性高血壓模型?！?Wistar大鼠在術前禁食。用30 g·L-1的水合氯醛(1 mL·100 g-1)腹腔注射麻醉，固定于鼠板，無菌操作，在左側腎臟區域做切口，腹膜外進入，打開腹腔，暴露左側腎臟。分離左側腎動脈，把直徑為0.20 mm的針灸針與血管長軸并置，并用手術絲線(4號)結扎，然后拔出針灸針造成左側腎動脈狹窄，右腎未觸及，假手術組方法相同但不結扎左腎動脈。模型判斷標準：造模后血壓比造模前高2.66 kPa(大于正常血壓3個標準差)以上，且收縮壓高于18.62kPa視為模型成功，達到腎血管性高血壓的標準，血壓未達到以上標準的模型大鼠棄之不用。造模成功大鼠隨機分為2KIC組(n=7只)，2KIC+NaHS組(n=8只)，PPG組(n=7只)。另設假手術組6只。2KIC+NaHS組從術后第二日每日腹腔注射NaHS(56 μmol·kg-1)[6]，PPG組每日腹腔注射0.25 mL PPG(37.5 mg·kg-1)，假手術組、2KIC組每日腹腔注射0.25 mL無菌注射用水作為對照，連續用藥4周。

1.3.2血壓測定術前及術后每周，采用尾容積法測清醒時大鼠的尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)。測量前大鼠預熱10～15 min，將鼠尾套入尾套，待動物安靜后充氣測收縮壓，重復3次，取平均值。

1.3.3血管形態學觀察頸總動脈用體積分數為0.1的甲醛固定、沖水、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片、染色、封固。電腦圖形分析儀檢測頸總動脈外周徑、壁厚、壁厚外周徑比。

1.3.4頸總動脈舒縮反應的測定采用RM-6240生物信號采集處理系統。取約3～4 mm的頸總動脈置于盛有K-H液的 37℃恒溫浴槽中，將其一端掛于鋼絲上，另一端與張力換能器相連，持續記錄血管環張力變化。先用收縮劑去甲腎上腺素(Norepinephrine, NE 1 μmol·L-1)預收縮后，再累積加入ACh溶液，持續記錄血管的張力變化。

2　結果

2.1血壓的變化腎動脈狹窄術后1周，2K1C組大鼠血壓即有明顯升高，且明顯高于sham組[(21.29±0.51) kPavs(14.63±0.55) kPa,P<0.05]；2K1C+NaHS組血壓升高，但與2K1C組相比，沒有明顯差異；PPG組血壓比sham組略高，差異沒有統計學意義；術后第2周開始，2K1C+NaHS組血壓開始逐漸降低，術后3周與2KIC組比較差異具有顯著性(P<0.05)；PPG組血壓逐漸升高，術后4周與sham組比較差異具有顯著性(P<0.05)。

Tab 1　Changes of rat tail artery blood pressure in different ±s,kPa)

#P<0.05 2K1C groupvssham group;*P<0.05 2K1C+NaHS groupvs2K1C group;△P<0.05 PPG groupvssham group

2.2血管形態學改變在顯微鏡下觀察結果表明，與假手術組大鼠比較，2KIC組及PPG組大鼠的血管外周徑、壁厚及壁厚與血管外周徑的比值均明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；2K1C+NaHS組血管形態結構明顯改善(Tab 2)。

#P<0.05 2K1C groupvssham group;*P<0.05 2K1C+NaHS groupvs2K1C group;△P<0.05 PPG groupvssham group

Tab 2　Comparison of morphometric parameters

*P<0.05 2K1C,PPGvssham；△P<0.05 2K1C+NaHSvs2K1C

2.3血管舒縮反應在各組均觀察到ACh(10-8～10-4mol·L-1)劑量依賴性地血管舒張反應。外源性給予H2S(2K1C+NaHS組)能明顯增加模型大鼠內皮依賴性舒張反應，與2KIC組比較，差異有顯著性(P<0.05)(Fig 2)。

2.4血管中eNOS；ET-1的表達見Fig 3，4。由圖可見，2K1C和PPG組ET-1蛋白表達高于sham組(P<0.05)，eNOS蛋白表達降低；與2K1C組比較，2K1C+NaHS組ET-1表達明顯降低(P<0.05)，eNOS蛋白表達有所升高，差異有顯著性。

3　討論

在術后的第1周，2K1C組大鼠收縮壓即明顯升高，達到高血壓模型診斷標準，表明模型制備成功。對腎血管性高血壓大鼠外源性補充H2S(2K1C+NaHS組)，升高的血壓逐漸降低，提示H2S 不僅可以防止高血壓的進一步發展，還可以降低已經升高的腎血管性高血壓大鼠的血壓；以往的研究表明，內源性H2S參與基礎血壓的維持和高血壓的發展[7]。PPG(DL-propargylglycine)為硫化氫代謝酶抑制劑，抑制內源性H2S的合成。我們給大鼠腹腔注射PPG，結果血壓在術后1周略有升高，但沒有統計學意義，可能與給藥時間較短，對內源性H2S的抑制作用較弱有關。隨著PPG的持續給藥，體內H2S的生成逐步被抑制，血壓也逐步升高并發展成高血壓。這些都說明，體內H2S體系參與腎血管性高血壓的形成和發展。

Fig 2　Endothelium-dependent relaxation of carotid artery induced by Ach in different groups

Fig 3　The protein expression of eNOS in different groups

Fig 4　The protein expression of ET-1 in different groups

有研究證實，H2S可以通過舒張血管平滑肌、抑制血管平滑肌細胞增殖而調節血管重構發揮抗高血壓的作用[8]。本實驗結果顯示，腎血管性高血壓大鼠由于血管平滑肌細胞增殖使血管壁變厚，壁厚與外周徑的比值增大；外源性給予H2S后，血管壁厚及壁厚與外周徑的比值均減小，說明H2S可以抑制血管平滑肌細胞增殖，抑制血管的重構。血管的內皮依賴性血管舒張反應結果也顯示發生腎血管性高血壓時血管舒張能力減弱，而H2S可改善ACh介導的血管舒張反應，改善血管的舒縮功能，抑制血壓的升高。有研究表明，內源性的H2S可以獨立或與NO協同舒張血管平滑肌[9]，H2S改善其內皮依賴的舒血管效應可能還與其調節內皮釋放NO有關。本實驗中，檢測了NO/cGMP信號途徑的關鍵酶eNOS，結果發現，模型組eNOS表達減少，進一步證明了NO減少在高血壓的發展過程中發揮了重要作用，而H2S可以明顯增加模型大鼠eNOS的表達，獨立或與NO協同舒張血管，降低血壓。內皮素(endothelin,ET)是迄今所知最強的縮血管物質[10]，參與高血壓狀態的發生與維持。本研究檢測了主要表達的ET-1的含量，發現在模型中ET-1表達較對照組明顯升高，而外源性給與H2S可以明顯增加降低大鼠ET-1的表達。

NO和ET的生成量及二者之間平衡的失調是動脈內皮受損的明顯特征，血管內皮受損又導致其功能紊亂，而血管內皮功能紊亂最重要、最早期的表現就是血管內皮依賴性舒張功能的減弱或喪失，本實驗模型組的實驗結果也證實了這點。而H2S可以明顯增加eNOS的表達，減少ET-1表達，恢復維持血管結構和功能的這種平衡，這可能是其改善血管的舒縮功能，抑制血壓升高的機制之一。

(致謝:感謝新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室李東亮教授和趙紅崗老師給予本實驗的指導和支持! )

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Effects of hydrogen sulfide on arterial vasodilatation function of renal hypertensive rats

PAN Guo-pin1，ZHANG Xiao-yi1，LI Dong-liang2，ZHAO Hong-gang2，LIU Rui-li1

(1.CollegeofPharmacy,XinxiangMedicalUniversity;2.DeptofPhysiologyandNeurobiology,XinxiangMedicalUniversity,XinxiangHenan453003,China)

AimTo investigate the modulation effects of NaHS on arterial vasodilatation functions of renal hypertensive rats.MethodsTwo- kidney, one- c lip ( 2K1C ) renovascular hypertension was induced.Rats were randomly divided into four group：sham group，two-kidney one-clip model(2K1C) group,2KIC+NaSH(H2S donor) group,PPG group. The systolic blood pressure(SBP) was measured before the operation and each week after the operation. The carotid artery was collected for morphometric parameters(outer radius,wall thickness,the radio of wall thickness to outer radius) and the tension of the carotid artery was observed with the isolated artery ring technique. Immunohistochemistry was used to determine the protein expression of eNOS,ET-1 protein in carotid artery.ResultsThe blood pressure of 2K1C group and PPG group was higher than that of sham group(P<0.05).Compared with 2K1C group,the blood pressure and the rat arteria carotis communis of the radio of wall thickness to outer radius of 2K1C+NaHS group decreased significantly，while the relaxation of carotid artery to ACh in NaHS group increased.According to the immunohistochemistry results,eNOS expression was upregulated while ET-1 was downregulated in 2K1C+NaHS group as compared with 2K1C group.ConclusionsChronical administration of NaHS can decrease blood pressure in renovasocular hypertensive rats. The antihypertensive effect of H2S maybe associated with improvement of the arterial functions.

hydrogen sulfide; renovascular hypertension; 2K1C; endothelial dependent; eNOS；ET-1

2016-02-10,

2016-04-22

國家自然科學基金資助項目(No 81271376)

潘國聘(1981-)，女，碩士，研究方向：心腦血管藥理學，E-mail：wsxiaopin@aliyun.com；劉瑞麗(1975-)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：神經藥理學，通訊作者，E-mail：lrl @xxmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.014

A

1001-1978(2016)07-0956-04

R-332；R322.121；R331.32；R544.140.22

網絡出版時間：2016-6-20 11:49網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.028.html