宮內缺氧對子代大鼠血漿及肝臟RAS的影響

茅彩萍，仲婷婷，陳　楠，姜　珊，張象威，曹　莉,

(1. 蘇州大學藥學院藥理學教研室，江蘇 蘇州　215123；2. 蘇州大學附屬第一醫院胎兒醫學研究所、生殖醫學中心，江蘇 蘇州　215006)

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宮內缺氧對子代大鼠血漿及肝臟RAS的影響

茅彩萍2，仲婷婷1，陳楠1，姜珊2，張象威1，曹莉1,2

(1. 蘇州大學藥學院藥理學教研室，江蘇 蘇州215123；2. 蘇州大學附屬第一醫院胎兒醫學研究所、生殖醫學中心，江蘇 蘇州215006)

目的研究宮內缺氧(PH)對子代大鼠血液循環系統和肝臟局部腎素-血管緊張素系統(RAS)的影響，以探討PH導致子代脂肪肝易感性增加的可能機制，尋找藥物干預靶點。方法利用飼養艙飼養建立妊娠期宮內缺氧大鼠模型，分別稱量孕21 d胎鼠、成年子代大鼠(5月齡)、成年子代大鼠缺氧應激(7 d)后的體重、肝重，并計算肝重指數，檢測大鼠血漿及肝臟中AngⅠ、AngⅡ和ACE的含量。結果與正常組相比，PH組胎鼠體重、肝臟重量及肝重指數明顯下降，成年后各組這些差別消失；但給予7 d缺氧應激后，PH成年子代大鼠肝重及肝重指數較正常成年子代明顯升高。胎鼠兩組間和成年子代大鼠兩組間血漿及肝臟中AngⅠ和ACE含量均無顯著差異；PH成年子代肝臟中AngⅡ含量明顯高于正常子代。經過7 d缺氧應激后，大鼠肝臟中的AngⅠ含量和血漿及肝臟中AngⅡ含量均較未缺氧應激組明顯升高；宮內缺氧成年子代大鼠肝臟中ACE含量和血漿及肝臟中AngⅡ含量升高幅度均明顯大于正常成年子代組。結論PH可引起子代胎兒期及成年后肝臟局部RAS組份含量增高，使得其子代成年后RAS在缺氧刺激后更易被激活，這可能是PH導致子代脂肪肝易感性增加的機制之一。

宮內缺氧；子代；腎素-血管緊張素系統；肝臟；胎兒；血漿

大量研究表明胎兒宮內缺氧(prenatal hypoxia，PH)不僅會引起胎兒宮內生長受限，還會造成胎兒重要組織器官的發育不良，以及成年后的代謝異常[1]。我們以往的研究也表明：PH可引起子代成年后胰島素敏感性降低和肝臟胰島素信號通路異常，導致子代大鼠成年后非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)易感性增加[2]。腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)是一種重要的維持機體內環境穩態的激素內分泌系統，由血管緊張素原、腎素、血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)、血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ， AngⅠ)、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ， AngⅡ)及其相應的受體AT1、AT2構成。近年來諸多研究報道RAS在胰島素抵抗(insulin resistance, IR)發生和發展的多個環節中發揮重要作用[3]，并可通過介導氧化應激誘發大鼠患非酒精性脂肪肝[4]。RAS阻斷劑可提高機體胰島素敏感性，有效逆轉肝臟的脂肪沉積及其導致的炎癥損傷[5]。RAS系統在胎兒期對機體組織器官的生長發育產生重要影響，胎兒期缺氧可通過RAS介導的“印跡”機制增加出生后個體心腦血管發病的危險性[6]。但PH是否亦可通過RAS系統改變以影響胎兒肝臟，目前國內外尚未見報道。本文在以往研究的基礎上，觀察了PH對子代大鼠血液循環系統和肝臟局部RAS的影響，探討PH導致子代NAFLD易感性增加的可能機制，以期尋找藥物早期干預的靶點。

1　 材料

1.1藥品與試劑水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)；EDTA(Sigma，美國)；氮氣、液氮(蘇州長橋氣體公司)；AngⅠ、AngⅡ、ACE放免試劑盒(北京華英生物技術研究所)；生理鹽水(江蘇鵬鷂藥業有限公司)。

1.2實驗儀器Centrifuge 5417R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；氧氣含量監測儀(S-450，美國IST-AIM公司)；Architect c8000全自動血液生化分析儀(美國Abbott公司)；冰凍切片機(德國Leica公司)；AH-2光學顯微鏡、數碼相機(日本Olympus公司)；r-911全自動放免計數儀(中國科技大學實業總公司生產)。

2　方法

2.1建立動物模型及分組將♀♂大鼠以1 ∶1合籠，次日晨檢測陰栓判斷為妊娠時，記為妊娠d 1(GD 1)，孕鼠隨機分為對照組及缺氧組，每組10只。將缺氧組孕鼠于GD 4～21放入缺氧艙(體積：140L，O2含量(10±0.5)%，對照組放于氧含量正常的等體積飼養艙中飼養(O2含量21%)。GD 21行剖宮產，每窩隨機取2只胎鼠，交予 “奶媽”母鼠正常喂養，其余胎鼠按母鼠妊娠期是否受缺氧刺激分為正常組(FC)和PH組(FH)。將子代成年大鼠分為4組，每組10只(♀♂各半)：① 正常子代組(O-FC-C)；② 宮內缺氧子代組(O-FH-C)；③ 正常子代成年缺氧應激組(O-FC-H)；④宮內缺氧子代成年缺氧應激組(O-FH-H)。5月齡后將成年后缺氧應激組給予短期缺氧刺激，方法同上，時間為7 d。動物處死前均稱量體重。

2.2血樣采集及血漿制備對胎鼠采用斷頭取血法，將血樣收集到含EDTA的抗凝試管中，1 000 r·min-14℃離心10 min，分離血漿。子代成年大鼠禁食不禁水10 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，分離血漿，-20℃保存待檢。

2.310%肝臟組織勻漿液制備分離完整的胎鼠及子代成年大鼠肝臟，稱重，并計算肝重指數；肝重指數=肝重/體重。稱取0.3 g肝組織加液氮研磨成細粉后，加入生理鹽水至3 mL,充分混勻，1 000 r·min-1離心10 min，分離上清液，-20℃保存待檢。

2.4肝組織冰凍切片的制備及蘇丹Ⅲ染色快速分離子代大鼠肝臟，切下直徑約2 cm的肝組織(胎鼠取整個肝臟)，放入-15℃冰箱冷凍。將已冷凍的組織放在組織支承器上，滴上包埋劑，冰凍，切出8 μm厚的冰凍切片，福爾馬林中固定10 min，稍水洗后，用乙醇稍洗，蘇丹III染液浸染2 min，乙醇洗去多余染液，繼而流水沖洗。用蘇木精染液復染細胞核，鹽酸酒精分化，水洗10 min藍化，把切片貼于載玻片上，甘油明膠封蓋，光學顯微鏡下觀察，拍照。

2.5血漿及肝勻漿中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的檢測將血漿和10%肝組織勻漿分別上全自動生化分析儀檢測。

2.6血漿及肝勻漿中AngⅠ、AngⅡ、ACE的檢測由北京華英生物技術研究所用放免法代為檢測。

3　結果

3.1PH對子代大鼠體重、肝重及肝重指數的影響FH組胎鼠較FC組體重、肝重及肝重指數均明顯降低(P<0.05)。子代成年O-FC-C組與O-FH-C組之間體重、肝重及肝重指數均無差別。子代成年大鼠給予短期缺氧刺激后，O-FH-H組肝重指數較O-FH-C組明顯升高(P<0.05)，O-FH-H組大鼠肝臟重量及肝重指數明顯高于O-FC-H組(P<0.01)，見Tab 1。

Tab 1　Effect of prenatal hypoxia on body weight, liver weight and liver weight to body weight ratio in fetus and offspring ±s，n=10)

ΔΔP<0.01vsFC;#P<0.05vsO-FH-C;*P<0.05,**P<0.01vsO-FC-H

3.2PH對子代成年大鼠和胎鼠肝組織脂肪沉積的影響O-FC-C組大鼠的肝組織未見明顯的紅染脂滴，O-FH-C組和O-FC-H組大鼠的肝組織中見少量紅染脂滴。O-FH-H組大鼠肝組織出現大量紅染脂滴。GD21胎鼠，FC組肝組織中有少量紅染脂滴。FH組胎鼠的肝組織結構松散，因而冰凍切片出現大塊空斑，并見大量紅染脂滴，見Fig 1。

3.3PH對胎鼠和子代成年大鼠血漿及肝組織中TG、TC含量的影響子代成年大鼠各組間血漿中TG、TC含量均未見差異(P>0.05)；FH組胎鼠與FC組比較，血漿中TG、TC含量也均未見差異(P>0.05)。子代成年大鼠各組間及FH組胎鼠與FC組之間，肝組織中TC含量也均未見差異(P>0.05)。TG含量，O-FH-C組和O-FC-H組大鼠與O-FC-C組相比雖有所增高，但差異均無統計學意義(P>0.05)。而O-FH-H組大鼠肝組織TG含量較O-FH-C組和O-FC-H組明顯增高(P<0.05)。FH組胎鼠肝組織TG含量比FC組明顯增高(P<0.01)，見Tab 2。

3.4PH對子代大鼠血漿中AngⅠ、AngⅡ及ACE含量的影響兩組胎鼠間血漿中無論是AngⅠ、AngⅡ，還是ACE的含量均未見差異；子代成年大鼠O-FH-C組與O-FC-C組兩組相比，血漿中AngⅠ、AngⅡ和ACE含量也均無差異(P>0.05)。子代成年大鼠給予缺氧刺激后，血漿中AngⅠ和ACE含量未見改變；但AngⅡ含量升高，PH子代O-FH-H組大鼠血漿中AngⅡ含量明顯高于O-FC-H組和O-FH-C組(P<0.05)，見Fig 2。

Tab 2　Effect of prenatal hypoxia on TC and TG in plasma and liver of fetus and offspring ±s，n=10)

ΔΔP<0.01vsFC;#P<0.05vsO-FH-C;**P<0.01vsO-FC-H

Fig 1　Light microscopic micrographs for liver tissues staining with Sudan Ⅲ

A: FC; B:FH; C:O-FC-C; D:O-FH-C;E:O-FC-H;F:O-FH-H

3.5PH對子代大鼠肝臟組織中AngⅠ、AngⅡ及ACE含量的影響FH組胎鼠較FC組肝勻漿中AngⅡ含量有所增高，但差異無統計學意義(P>0.05)，兩組胎鼠肝勻漿中AngⅠ、ACE含量也均無差異。子代成年O-FH-C組大鼠肝組織中AngⅡ含量與O-FC-C組相比明顯增高(P<0.05)，AngⅠ、ACE含量雖有所不同，但兩組差異無顯著性(P>0.05)。子代成年大鼠給予缺氧刺激后，AngⅠ、AngⅡ含量較缺氧前明顯升高(O-FC-HvsO-FC-C；O-FH-HvsO-FH-C);(P<0.05)；O-FH-H組大鼠肝勻漿中AngⅡ含量較O-FC-H組明顯增高(P<0.05)，AngⅠ含量也有增高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；肝組織中ACE含量，O-FC-H組與O-FC-C組相比有所降低，但差異無顯著性(P>0.05)，O-FH-H組與O-FC-H組和O-FH-C組相比均明顯增高(P<0.05)，見Fig 3。

4　討論

妊娠期母體的多種疾患及環境因素都可引起胎兒宮內缺氧(PH)[7-8]。我們以往的研究結果表明：PH可造成子代成年后胰島素敏感性降低和肝臟胰島素信號通路異常，致使子代大鼠成年后NAFLD易感性增加[2]。本研究結果顯示：PH胎鼠的體重、肝重及肝重指數均明顯低于正常胎鼠，這說明PH不僅造成胎鼠的宮內生長受限，而且還抑制了其肝臟的生長發育。PH子代大鼠5月齡(成年)時，經過“追趕生長”，其與同齡正常子代體重、肝重及肝重指數差異均消失。這種“追趕生長”是在PH子代出生前特殊的代謝應答模式基礎上完成的，它常伴有胰島素及瘦素的抵抗、脂質水平改變[9]，成為子代成年后NAFLD易感性增加的原因之一。

Fig 2　Effect of prenatal hypoxia on plasma AngⅠ, AngⅡ

1: FC; 2: FH; 3: O-FC-C; 4: O-FH-C; 5: O-FC-H; 6: O-FH-H.*P<0.05vsO-FC-H;#P<0.05vsO-FH-C.

Fig 3　Effect of prenatal hypoxia on 10%(wt/vol) liver homogenate AngⅠ,AngⅡ and ACE concentration in fetus and offspring ±s，n=10)

1: FC; 2: FH; 3: O-FC-C; 4: O-FH-C; 5: O-FC-H; 6: O-FH-H.ΔP<0.05vsO-FC-C;*P<0.05vsO-FC-H;#P<0.05vsO-FH-C.

腎素-血管緊張素系統(RAS)在血壓、體液、電解質平衡中起重要作用。多種因素可促使腎小球旁器中的球旁細胞釋放腎素，腎素作用于肝臟和脂肪組織產生的血管緊張素原，使其生成AngⅠ；AngⅠ在ACE作用下裂解轉化為AngⅡ[10]。AngⅡ是RAS的關鍵因子[11]。以往認為[12-13]，RAS是屬于循環內分泌系統，后來諸多研究表明，在心、腎、肺、肝和胰腺中都存在著局部RAS，在這些組織中AngⅡ可以不釋放到血液中，可通過自分泌、旁分泌或胞內分泌等方式局部發揮作用。近年來，研究者發現胰島素信號與RAS之間存在著復雜的調控網絡，并嘗試用RAS調節劑來治療和預防肝臟疾病。對循環系統及肝臟局部RAS的調控均有利于預防NAFLD和肝纖維化的發生[14]。本研究觀察了PH對子代大鼠血液循環系統和肝臟中AngⅠ、AngⅡ及ACE含量的影響。結果顯示：PH雖未表現出對胎鼠及子代成年的循環系統AngⅠ、AngⅡ及ACE含量的直接影響，但卻對其成年后肝臟局部RAS產生了“印跡”效應，PH成年子代肝臟中AngⅡ含量均明顯高于正常對照組。給予缺氧刺激后，PH子代成年大鼠機體RAS受到激活，且肝臟局部RAS的激活強于循環系統RAS。這說明PH不僅可造成子代成年大鼠肝臟的高AngⅡ狀態，還可使成年子代的RAS在缺氧刺激后更易被激活。有研究報道：給成年大鼠輸注AngⅡ可促進肝臟合成TG，進而增加血漿中TG含量[15]，并可通過介導氧化應激損傷線粒體誘發大鼠患NAFLD[16]。這說明PH子代成年延續自胎兒期的肝臟高AngⅡ水平是PH增加子代脂肪肝易感性的機制之一。肝臟局部RAS可能是藥物早期干預PH，導致子代NAFLD易感性增加的新靶點。

(本實驗在蘇州大學附屬第一醫院胎兒醫學研究所完成。感謝徐智策教授的指導與幫助！)

[1]Rueda-Clausen C F, Dolinsky V W, Morton J S,et al. Hypoxia-induced intrauterine growth restriction increases the susceptibility of rats to high-fat diet-induced metabolic syndrome[J].Diabetes,2011,60(2):507-16.

[2]Cao L, Mao C, Li S,et al. Hepatic insulin signaling changes: possible mechanism in prenatal hypoxia-increased susceptibility of fatty liver in adulthood[J].Endocrinology,2012,153(10):4955-65.

[3]Kalupahana N S, Moustaid-Moussa N. The renin-angiotensin system: a link between obesity, inflammation and insulin resistance[J].ObesRev,2012,13(2):136-49.

[4]張曉平，張峰，陸茵，等. 肝纖維化中腎素-血管緊張素的作用研究進展[J]. 中國藥理學通報,2011,27(7):897-900.

[4]Zhang X P, Zhang F, Lu Y,et al. Research progress on the role of renin-angiotensin system in hepatic fibrosis[J].ChinPharmacolBull, 2011,27(7):897-900.

[5]Toblli J E, Munoz M C, Cao G,et al. ACE inhibition and AT1 receptor blockade prevent fatty liver and fibrosis in obese Zucker rats[J].Obesity(SilverSpring),2008,16(4):770-6.

[6]Xue Q, Dasgupta C, Chen M, Zhang L. Foetal hypoxia increases cardiac AT(2)R expression and subsequent vulnerability to adult ischaemic injury[J].CardiovascRes,2011,89(2):300-8.

[7]Moazzen H, Lu X, Liu M, Feng Q. Pregestational diabetes induces fetal coronary artery malformation via reactive oxygen species signaling[J].Diabetes,2015,64(4):1431-43.

[8]Rueda-Clausen C F, Stanley J L, Thambiraj D F,et al. Effect of prenatal hypoxia in transgenic mouse models of preeclampsia and fetal growth restriction[J].ReprodSci,2014,21(4):492-502.

[9]Coupe B, Grit I, Darmaun D, Parnet P. The timing of "catch-up growth" affects metabolism and appetite regulation in male rats born with intrauterine growth restriction[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol,2009,297(3):R813-24.

[10]Cabello-Verrugio C, Morales M G, Rivera J C,et al. Renin-angiotensin system: an old player with novel functions in skeletal muscle[J].MedResRev,2015,35(3):437-63.

[11]田超，范方田，陳文星，等. 血管緊張素Ⅱ及其Ⅰ型受體在腫瘤血管生成中的作用研究[J]. 中國藥理學通報，2014，30(5)：608-11.

[11]Tian C, Fan F T,Chen W X, et al. Research progress on the function of angiotensin Ⅱ and its type Ⅰ receptor in tumor angiogenesis[J].ChinPharmacolBull,2014，30(5)：608-11.

[12]陳京紅. 局部腎素血管緊張素系統的生理學和藥理學意義[J]. 中國藥理學通報,1990,6(6):344-6.

[12]Chen J H. Physiology and pharmacology of local renin-angiotensin systems[J].ChinPharmacolBull, 1990,6(6):344-6.

[13]Ohashi N, Yamamoto T, Huang Y,et al. Intrarenal RAS activity and urinary angiotensinogen excretion in anti-thymocyte serum nephritis rats[j].AmJPhysiolRenalPhysiol,2008, 295(5): F1512-1518.

[14]Geogescu E F. Angiotensin receptor blockers in the treatment of NASH/NAFLD: could they be a first-class option[J]?AdvTher,2008,25(11):1141-74.

[15]Ran J, Hirano T, Adachi M. Chronic ANG Ⅱ infusion increases plasma triglyceride level by stimulating hepatic triglyceride production in rats[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab,2004,287(5):E955-61.

[16]Moreira de Macedo S, Guimaraes T A, Feltenberger J D, Sousa Santos S H. The role of renin-angiotensin system modulation on treatment and prevention of liver diseases[J].Peptides,2014,62:189-96.

Effects of prenatal hypoxia on renin-angiotensin system in plasma and liver of offspring rats

MAO Cai-ping2,ZHONG Ting-ting1,CHEN Nan1, JIANG Shan2, ZHANG Xiang-wei1,CAO Li1,2

(1.CollegeofPharmaceuticalSciences,SoochowUniversity,SuzhouJiangsu215123,China; 2.InstituteforFetology&ReproductiveMedicineCenter,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,SuzhouJiangsu215006,China)

AimTo study the effects of prenatal hypoxia on the risk of fatty liver disease to search the drug targets.MethodsIntrauterine hypoxia rats model was established. The bodies and livers of fetal rats of 21 days, and adult offspring rats of 5 months with and without anoxic treatment were all weighed. The liver index was calculated and the concentrations of renin-angiotensin system components in circulation system and livers of offspring rats were measured.ResultsThe weight of the bodies, livers and index of liver weight to body weight(liver index) were significantly decreased in the PH group compared with the normal group. These differences disappeared in adulthood. However, the liver index of adult offsprings in the PH group after hypoxia stress for 7 days was significantly increased compared with that of adult offsprings in normal group. There were no significant differences in the concentrations of AngⅠ, AngⅡ and ACE in plasma and livers between the two groups of fetal rats and the two groups of adult offspring rats separately. The concentrations of AngⅡ in the livers of adult rats in PH group were significantly higher than those in normal group. The concentrations of AngⅠ in livers and the concentrations of AngⅡ in plasma and livers in the group treated with hypoxia stress for 7 days were significantly higher than those without hypoxia stress. The concentrations of ACE in livers and the concentrations of AngⅡ in plasma and livers in PH adult offsprings were significantly higher than those of normal adult offsprings.ConclusionPH can induce the increase of RAS content in the livers of fetus and adult rats, RAS is more likely to be activated after hypoxia stimulation in the following adulthood. PH is a potential mechanism that mediates offspring susceptibility of fatty liver.

prenatal hypoxia; offspring; renin-angiotensin system; liver; fetus; plasma

2016-02-16,

2016-04-20

國家自然科學基金資助項目(No 30902018)；江蘇省博士后基金項目(No 1302063C)；蘇州大學大學生創新計劃項目(No 2013xj059)

茅彩萍(1968-)，女，博士，教授，研究方向：圍產生理藥理，E-mail:maocaiping@suda.edu.cn；仲婷婷(1994-)，女，本科生，研究方向：內分泌藥理，E-mail:841108240@qq.com；曹莉(1976-)，女，博士，副教授，研究方向：內分泌藥理學，通訊作者，E-mail:caoli8545@sohu.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.018

A

1001-1978(2016)07-0975-05

R-332；R322.47；R331；R714.5；R845.22

網絡出版時間：2016-6-20 11:49網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.036.html