卡托普利干預自發性高血壓大鼠血清代謝組學研究

楊雯晴，蔣海強，李運倫，臧沿平，褚巖珺

(山東中醫藥大學 1.第一臨床醫學院，2.實驗中心，山東 濟南　250355；3. 山東中醫藥大學附屬醫院高血壓國家中藥臨床研究基地，山東 濟南　250011)

?

卡托普利干預自發性高血壓大鼠血清代謝組學研究

楊雯晴1，蔣海強2，李運倫3，臧沿平1，褚巖珺1

(山東中醫藥大學 1.第一臨床醫學院，2.實驗中心，山東 濟南250355；3. 山東中醫藥大學附屬醫院高血壓國家中藥臨床研究基地，山東 濟南250011)

目的通過代謝組學方法研究卡托普利干預自發性高血壓大鼠血清內源性代謝物的變化，進一步探索卡托普利的作用機制。方法采用快速高分離液相-四級桿飛行時間串聯質譜聯用技術采集大鼠血清內源性代謝物信息，經偏最小二乘法判別分析，識別顯著差異的變量，鑒定潛在生物標志物。結果正常組、模型組、卡托普利組的血清內源性代謝物、代謝模式發生了明顯變化。經數據庫查詢共確定了4個生物標記物及其代謝途徑，與血管內皮功能密切相關。結論代謝組學從機體整體代謝角度揭示了卡托普利保護血管內皮功能的可能作用機制，在闡釋藥物復雜的作用機制方面顯示出了獨特的潛力。

卡托普利；代謝組學；血管內皮功能；自發性高血壓大鼠；快速高分離液相-四級桿飛行時間串聯質譜聯用技術；生物標志物

卡托普利(captopril)是臨床常用的血管緊張素轉化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)，對高血壓患者具有良好的靶器官保護和心血管終點事件預防作用[1]。在近幾年的臨床研究中發現[2]，卡托普利可以減輕患者血流動力或代謝異常，延緩左室肥厚，以及改善血管內皮功能，但其具體的作用途徑目前尚需要進一步探索。

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白組學后系統生物學的一個重要分支，應用分離和檢測技術獲取能夠表征代謝物的小分子集合[3]，以研究關于生物體被擾動后其內源性代謝產物種類、數量及變化規律[4]。近年來，它在疾病標志物的發現、疾病診斷、藥物藥效和毒性評價等方面得到廣泛研究和應用。生物體在疾病狀態下代謝網絡發生缺陷，藥物干預使缺陷部分正常化，利用代謝組學方法可以從微觀角度檢測生理、病理、藥物干預前后內源性代謝產物的變化特征，從小分子水平闡釋藥物作用靶點及作用機制。本實驗借助快速高分離液相-四級桿飛行時間串聯質譜聯用(rapid resolution liquid chromatography/quadrupole-time of flight tandem mass spectrometry, RRLC-Q-TOF-MS)作為研究手段，分析卡托普利干預自發性高血壓大鼠(SHR)前后血清內源性代謝產物的變化特征，以進一步探索卡托普利的作用機制。

1　材料

1.1動物8周齡♂ SHR(SPF級)12只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證書：SCXK(京)2006-0009。8周齡♂ Wistar大鼠(SPF級)6只，購自山東中醫藥大學實驗動物中心，合格證書：SCXK(魯)20051015。

1.2實驗藥物卡托普利片(廣州白云山制藥廠產品，批號H44021739)粉碎、研細，加入生理鹽水適量制成濃度2.08 g·L-1的混懸液，置4℃冰箱保存備用。

1.3儀器和軟件ALC-NIBP型清醒大鼠血壓心率測定儀(上海奧爾科特生物科技有限公司)；ALC-HTP動物恒溫系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)；ALC-NIBP無創血壓測量分析系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)；快速高分離液相-四級桿飛行時間串聯質譜聯用儀(Agilent 6520 RRLC-Q-TOF，Agilent Cor.美國)，色譜柱為Zorbax SB-C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)， Masshunter工作站、Agilent Quanlitative Analysis質譜分析軟件和Mass Profiler Professional數據處理軟件(Agilent Cor.美國)；SIMCA-P(version 11.5，Umetrics AB，Umea，Sweden)。乙腈、甲醇(色譜純，Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；水(Milli-Q超純水)。其他試劑均為分析純。

2　實驗方法

2.1動物分組及給藥方法8周齡♂ SHR12只，隨機分成模型組與卡托普利組，每組6只，并設Wistar大鼠6只作為正常組。卡托普利組給予卡托普利25 mg·kg-1，模型組和正常組給予等量的生理鹽水。每天1次，持續用藥28 d，每周測定動物體重調整給藥劑量。

2.2血壓檢定分別于給藥后第1周末、第2周末、第3周末、第4周末，采用無創性尾動脈脈搏間接測壓法測量各組大鼠清醒狀態下尾動脈收縮壓，連續測量3次，取平均值作為應測血壓值。

2.3樣品采集與制備末次用藥24 h后，麻醉大鼠，下腔靜脈取血，2 500 r·min-1離心15 min，取上清液，得血清，存于-80℃冰箱。用時室溫解凍，精密移取血清500 μL，加入1 000 μL甲醇，渦旋2 min，冰箱4℃冷藏4 h，置離心機13 000 r·min-1離心15 min，傾出上清液，微孔濾膜濾過后置于液相進樣瓶中，-20℃下保存，4℃進樣。

2.4分析條件色譜條件：柱溫25℃，流速0.3 mL·min-1，進樣量為10 μL。流動相為0.1%甲酸-水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(V/V)，0～20 min，5%～80% B；20～30 min，80%～90% B；30～40 min，90%～95% B。質譜條件：采用標準電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，檢測參數設置為毛細管電壓4 kV，霧化氣壓為35 psi，干燥氣流速9 mL·min-1，干燥氣溫度350℃，碎片電壓175 V，參比離子質荷比(m/z)121.050873和922.009798，質量數掃描范圍m/z 100～1 000。

2.5數據處理運用Agilent Quanlitative Analysis軟件查找未知化合物，歸類，給出化合物的“Feature 分子特征”。運用MPP進行保留時間校準、峰對齊、基線校準、數據的歸一化和對數轉換。初始過濾器可以通過豐度、保留時間范圍或質量范圍進行濾噪，根據80%規則，進一步去除在某一組中出現頻率(非零值)低于80%的化合物。通過MPP的統計分析功能，對于3組數據選用ANOVA分析，并采用Turkey post hoc檢驗進行多重比較(P<0.05)。P值<0.05的差異變量，再通過趨勢分析-倍數變化過濾器，把模型組設為對照條件，即正常組與模型組或卡托普利組與模型組對比，保留能有一組滿足倍數變化(FC=2)的變量。將經過MPP處理找到的變量，導入SIMCA-P，進行有監督的偏最小二乘法-判別分析(partial least-square discriminant analysis，PLS-DA)，選擇變量投影重要性(variable importance for the projection，VIP)>1的變量為潛在生物標志物[5]。根據化合物的精確分子量查詢METLIN(http://www.metlin.scipps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)、KEGG(http://www.kegg.com)3個在線數據庫，參照有關文獻，分析化合物質譜，鑒定化合物結構，并進一步發現代謝物相關代謝通路。

3　結果

3.1各組大鼠收縮變化給藥前，模型組大鼠血壓明顯高于正常組(P<0.05)，與卡托普利組差異無統計學意義(P>0.05)。給予卡托普利1周后與給藥前相比即出現血壓的下降(P<0.05)，隨著干預時間的延長，降壓效果逐漸增強，較模型組差異具有統計學意義(P<0.05)。而整個實驗過程中，正常組與模型組大鼠血壓水平穩定，與干預前無明顯波動(P>0.05)。結果見Tab 1。

3.2血清樣品的LC-MS分析應用LC-MS進行分離檢測，使用正離子模式，測定大鼠血清中的小分子代謝產物。Fig 1為正離子模式下典型的血清總離子流圖，可以發現正常組、模型組與卡托普利組存在一定的差別。

3.3偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)采用有監督的多維統計分析方法對3組樣本之間的差異進行分析。由Fig 2可知，模型組在空間上與正常組無交叉和重疊，區分良好，提示正常大鼠與SHR代謝模式存在明顯差異；卡托普利組在空間上與模型組相互分離，提示經卡托普利干預后SHR血清代謝模式發生改變。所建模型變量的擬合能力指數(R2Y)為 0.899，模型的預測指數Q2為0.632，提示模型的擬合能力和預測能力良好。

3.4生物標記物的鑒定及相應代謝途徑分析根據多元統計中變量的載荷大小是代謝組學中尋找生物標記物的常用方法。在PLS-DA模型中，VIP值越大對分組的貢獻也越大，選擇VIP>1，且具有統計學意義的變量作為潛在生物標志物的鑒別依據[5]，如Fig 3。再結合質譜同位素匹配結果和代謝物數據庫檢索，對潛在的生物標志物進行鑒定，結果如表2所示。為進一步比較卡托普利對篩選出的潛在靶標代謝物的干預作用，比較了這4個代謝物的峰強度，見Fig 4所示。通過對大鼠血清樣品進行分析，發現與正常組相比，模型組大鼠血清中鞘氨醇以及溶血磷脂酰膽堿的含量升高，同時油酸酰胺的含量下降，其代謝紊亂主要與鞘脂類代謝、脂肪酸代謝以及甘油磷脂代謝相關。經卡托普利干預后不同程度地糾正了代謝的異常，說明卡托普利對SHR有調節作用。

Tab 1　Change of systolic blood pressure in each ±s，mmHg)

*P<0.05vsmodel group；#P<0.05vsprevious administration; 1 mmHg=0.133 kPa

Fig 1　Representative total ion current chromatograms of rat serum

A：Normal group；B：Model group；C：Captopril group(1. Sphinganine，2. Oleamide，3. LysoPC(18 ∶0)，4.LysoPC(16 ∶0))

Fig 2　Score scattering plots of PLS-DA of metabonome of rat serum in three groups

4　討論

血管內皮細胞是血管內平衡的主要調節器，參與血管張力和結構調整。在高血壓病理狀態下，體內血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的濃度升高，激活AT1受體，使細胞內鈣離子濃度增加；或激活細胞膜表面的NADH/NADPH氧化酶，引起氧化應激反應[6]，均可導致血管內皮細胞的受損。因此，保護血管內皮功能是抗高血壓的一個重要目標。卡托普利作為第1個投入臨床使用的ACEI類藥物，不僅可以有效控制血壓，同時對大動脈乙酰膽堿依賴性舒張功能有一定的修復作用[7]，可以改善血管內皮功能，其機制與抑制血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme, ACE)，減少AngⅡ的生成有關[8]。

Tab 2　Potential biomarkers in rat serum and metabolic pathway

atrends of model group compared with normal group and Captopril group of metabolites (↑): up-regulated, (↓): down-regulated

Fig 3　VIP score chart of PLS-DA

本課題組在卡托普利有效降低SHR收縮壓的基礎上，借助代謝組學的技術手段，對卡托普利干預后SHR 產生的內源性應答改變進行了分析，發現鞘氨醇、溶血磷脂酰膽堿、油酸酰胺在表達上存在差異，進一步研究發現其對血管內皮功能有著重要作用。

鞘氨醇(sphingosine，Sp)是鞘磷脂的主要代謝物之一。細胞內鞘脂代謝平衡是細胞穩態的重要方面，在細胞增殖、分化和凋亡的調節中發揮重要作用。目前研究證明，Sp是細胞增殖的負調控因子，能夠抑制細胞生長、促進細胞凋亡[9]。Sp誘導細胞凋亡涉及多種信號傳導途徑，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路是其中之一，有研究表明，Sp誘導細胞的凋亡依賴于p38MAPK的活化[10]。高血壓狀態下，AngⅡ作用于AT1R后，可激活磷脂酶C(PLC)，催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)。IP3促進細胞內釋放Ca2+，致使細胞內鈣升高，DAG激活磷酸激酶C(PKC)，進而活化MAPKs路徑，引起一系列細胞增殖分裂效應[11]。本實驗中，經卡托普利干預后，大鼠血清中Sp的含量降低，說明卡托普利通過抑制ACE，減少AngII的生產，進而影響了MAPKs路徑的活化，部分地抑制了Sp誘導的凋亡。

油酸酰胺(oleamide)，又稱順-9,10-十八碳烯酞胺(cis-9,10-octadecenoamide)，最初從被剝奪睡眠的貓的腦脊液中分離鑒定，是近幾年發現的內源性睡眠誘導物質，具有多種藥理學作用。有學者發現，油酸酰胺可以抑制由低鉀誘發的細胞凋亡，其作用機制與抑制蛋白酶caspase-3有關[12]。目前研究已證明[13]，大麻素樣作用的油酸酰胺對SHR主動脈具有舒張作用，與其能增強SHR感覺神經的活性有關。多種證據表明水解油酸酰胺和花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的酶同為脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)，兩者相互競爭性地抑制對方的水解[14]。在高血壓病理狀態下，AngⅡ激動AT1R后經Gq通路的作用，卵磷脂裂解產生AA。本實驗結果顯示，卡托普利組大鼠血清中油酸酰胺的含量較模型組增多，這可能與卡托普利干預后，AngII生成受到抑制，導致Gq通路激活受到影響，AA生成減少有關。但由于油酸酰胺生理作用的分子機制大部分還不清楚，其舒張血管的機制仍需要深入研究。

Ang Ⅱ通過激活AT1R活化NADPH氧化酶，產生氧化應激反應，并誘導活性氧(ROS)的產生[15]，而ROS在氧化修飾低密度脂蛋白(LDL)生成溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)中具有重要作用[16-17]。LPC是氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)的主要活性成分，具有細胞毒性，使內皮細胞變性、壞死、脫落，其含量高的時候會發生溶血反應，破壞纖溶和凝血系統的平衡[18]。LPC能激活PKC，通過Ca2+依賴或Ca2+非依賴途徑，導致血管平滑肌收縮，并抑制NO的釋放，導致內皮依賴性收縮，影響其依賴性舒張[19]。付云峰等[20]發現卡托普利對LPC所引起的血管內皮依賴性舒張反應的損害有明顯的保護作用，并推斷其可能與卡托普利能夠減少NO的滅活，以及降低內源性一氧化氮合酶(NOS)抑制劑的蓄積，增加內皮細胞NO的合成有關。本實驗中模型組大鼠血清LPC含量升高，經卡托普利干預后明顯下調，提示卡托普利在一定程度上參與了LPC的調節。但卡托普利是通過抑制AngⅡ的生成后，調控NADPH氧化酶的活化，減少ROS的產生，進而使LPC生成減少，還是直接抑制了LPC的生成，其中間的具體作用環節還需要進一步的實驗進行證明。

Fig 4　Comparison of different potential biomarkers in rat serum of normal group, model group and Captopril group after intervention

綜上所述，本課題組從代謝的角度，從小分子水平闡釋了卡托普利干預SHR后，通過抑制AngⅡ的生成，使AT1R激活減少，進而調節鞘氨醇、溶血卵磷脂、油酸酰胺等代謝產物的表達，達到保護血管內皮功能的目的。從整體改變與微觀轉化的角度，為探索卡托普利保護血管內皮功能的作用機制提供了新的靶點和思路。本課題組將進一步通過實驗驗證鑒定潛在生物標志物，以明確卡托普利保護血管內皮功能的信號傳導機制。

[1]Danchin N, Cucherat M, Thuillez C,et al. Angiotensin-converting enzyme inhibitors in patients with coronary artery disease and absence of heart failure or left ventricular systolic dysfunction:an overview of long-term randomized controlled trials[J].ArchInternMed,2006,166(7): 787-96.

[2]Simko F, Pechanova O, Krajcirovicova K,et al. Effects of captopril, spironolactone, and simvastatin on the cardiovascular system of non-diseased Wistar rats[J].IntJCardiol, 2015, 190:128-30.

[3]Kouskoumvekaki I, Panagiotou G. Navigating the human metabolome for biomarker identification and design of pharmaceutical molecules[J].JBiomedBiotechnol, 2011,ppi:525497.

[4]賈偉,蔣健,劉平,等.代謝組學在中醫藥復雜理論體系研究中的應用[J].中國中醫藥雜志,2006,31(8):621-4.

[4]Jia W, Jiang J, Liu P, et al. Application of metabonomics in conplicated theory system research of traditional Chinese medicine[J].ChinaJChinMatMed，2006，31(8):621-4.

[5]Chong I G,Jun C H. Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present[J].ChemometrIntellLabSystems, 2005,78(S1-2):103-12.

[6]Pueyo M E,Gonzalez W, Nicoletti A,et al. Angiotensin Ⅱ stimulates endothelial vascular cell adhesion molecule-1 via nuclear factor-kappa B activation induced by intracellular oxidative stress[J].ArteriosclerThrombVascBiol, 2000, 20(3): 645-51.

[7]王現珍,蔣嘉燁,陸家鳳,等. SHR高血壓進程中不同類型血管內皮功能損傷及藥物修復研究[J].中國藥理學通報,2010,26(2):163-8.

[7]Wang S Z, Jiang J H, Lu J F, et al. Study in the damage of endothelial function and administration recovery among different arteries during the developing progress of SHR[J].ChinPharmacolBull, 2010,26(2):163-8.

[8]劉和亮,趙金垣.血管緊張素轉換酶抑制劑對化學性急性呼吸窘迫綜和征治療作用的實驗研究[J].中華預防醫學雜志,2002,36(2):93-6.

[8]Liu H L, Zhao J H. An experiment study of therapeutic effect of ACEI on chemical induce ARDS in rats[J].ChinJPrevMed,2002,36(2):93-6.

[9]Cuvillier O. Sphingosine in apoptosis signaling[J].BiochimBiophysActa, 2002, 1585(2-3):153-62.

[10]Frasch S C,Nick J A,Fadok V A,et al. p38 mitogen-activated protein kinase-dependent and-independent intracellular signal transduction pathways leading to apoptosis in human neutrophils[J].JBiolChem, 1998, 273(14): 8389-97.

[11]Peng S, Qi Y, Christensen N,et al. Capture ElISA and in vitro cell binding assay for the detection of antibodies to human papillomavirus type 6b virus-like particles in patients with anogenital warts[J].Pathology,1999,31(4): 418-22.

[12]楊靜玉,吳春福,阿部和穗,松林則夫. 油酸酰胺對低鉀誘導的培養大鼠小腦顆粒細胞凋亡的抑制作用[J].中國藥理學會通訊,2000,17(2):33.

[12]Yang J Y, Wu C F, A B H S, Song L Z F. Inhibition effect of oleamide against apoptosis induced by low potassium in cultured rat cerebellar granule neurous[J].ChinPharmacolSocietyNewsletter, 2000,17(2):33.

[13]Hopps J J, Dunn W R, Randall M D. Enhanced vasorelaxant effects of the endocannabinoid-like mediator, oleamide, in hypertension[J].EurJPharmacol,2012,684(1-3):102-7.

[14]Mechoulam R, Fride E, Hanus L, et al. Anandamide may mediate sleep induction[J].Nature, 1997, 389(6646): 25-6.

[15]Abel Martin Garrido, Kathy K.Griendling. NADPH oxidases and angiotensin Ⅱ receptor signaling[J].MolCellEndocrinol, 2009, 302(2): 148-58.

[16]Wierzbicki A S,Chowienczyk P J, Cockcroft J R,et al. Cardiovascular risk factors and endothelial dysfunction[J].ClinSci, 2004,107(6): 609-15.

[17]戴文卓,石靜萍,林興建. 厄貝沙坦對溶血磷脂酰膽堿所致人靜脈內皮細胞損害的影響[J]. 中國卒中雜志, 2008, 3(10): 721-5.

[17]Dai W Z, Shi J P, Lin X J. The study of protection of irb on human umbilical vein endothelial cells impaired by lysophosphatidylcholine[J].ChinJStroke,2008,3(10): 721-5.

[18]宋丹軍,潘家琪,李鵬旭,等.溶血磷脂酰膽堿在肝臟疾病中的研究進展[J]. 中國藥理學通報,2014,30(12):1642-6.

[18]Song D J,Pan J Q,Li P X,et al.Research progress of lysophosphatidylcholines for liver diseases[J].ChinPharmacolBull,2014,30(12):1642-6.

[19]Ota Y, Kugiyama K, Sugiyama S, et al. Complexes of apoA-1 with phosphatidycholine suppress dysregulation of arterial tone by oxidized LDL[J].AmJPhysiol, 1997,273(3): 1215-22.

[20]付云峰,熊燕,鄧華菲,付四海. 卡托普利抗同型半胱氨酸和溶血性磷脂酰膽堿損傷大血管內皮功能[J]. 中國藥理學與毒理學雜志, 2003, 17(3): 179-83.

[20]Fu Y F, Xiong Y, Deng H F, Fu S H. Protection of captopril against homocysteine and lysophosphatidylcholine induced endothelium damage in isolated rat aorta[J].ChinJPharmacolToxicol, 2003, 17(3):179-83.

Intervention effect of Captopril on serum of spontaneous hypertension rats based on metabonomic research

YANG Wen-qing1, JIANG Hai-qiang2, LI Yun-lun3, ZANG Yan-ping1，CHU Yan-jun1

(1．TheFirstClinicalCollege,2.ExperimentalCenter,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;3.TraditionalChineseMedicineClinicalResearchBaseforHypertensionofAffiliatedHospitalofShandongUniversityof

TraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China)

AimsTo analyze the intervention effect of Captopril on serum endogenous metabolites alternations in spontaneous hypertension rats(SHR) and to investigate possible therapeutic mechanism.MethodsThe rapid resolution liquid chromatography/quadrupole-time of flight tandem mass spectrometry(RRLC-Q-TOF-MS) and technology coupled with partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) processed by SIMCA-P software were used to distinguish significantly different variables and identify potential biomarkers.ResultsCompared to the normal group, metabolic profiling changed significantly in model group and Captoril group. Totally 4 metabolins and their metabolic pathways were detected, which were closely related to the endothelial function.ConclusionMetabolomics reveals possible therapeutic mechanism of Captopril for protecting endothelial function from overall metabolism of the body. It also shows unique potential in terms of interpretation of the complex mechanisms of drugs.

captopril; metabonomics; endothelial function; spontaneous hypertension rats; RRLC-Q-TOF-MS; biomarkers

2016-02-18,

2016-04-04

中國博士后科學基金特別資助項目(No 2015T80741)；國家自然科學基金資助項目(No 81473653)

楊雯晴(1987-)，女，博士生，研究方向：中醫藥治療高血壓，E-mail：winnie0416q@163.com；蔣海強(1982-)，男，博士，碩士生導師，通訊作者，E-mail：jhq12723@163.com；李運倫(1969-)， 男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中醫藥治療高血壓，通訊作者，E-mail：li.yunlun@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.022

A

1001-1978(2016)07-0998-06

R-332；R322.12；R349.1；R544.1；R972.4

網絡出版時間：2016-6-20 11:49網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.044.html