越鞠甘麥大棗湯對抑郁子代小鼠海馬Akt及m-TOR分子表達的影響

吳如燕，陸　彩，陶偉偉，夏寶妹，薛文達，任　荔，吳顥昕，陳　剛

(南京中醫藥大學基礎醫學院中醫腦病重點實驗室，江蘇 南京　210046)

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越鞠甘麥大棗湯對抑郁子代小鼠海馬Akt及m-TOR分子表達的影響

吳如燕，陸彩，陶偉偉，夏寶妹，薛文達，任荔，吳顥昕，陳剛

(南京中醫藥大學基礎醫學院中醫腦病重點實驗室，江蘇 南京210046)

目的觀察越鞠甘麥大棗湯對子代抑郁癥的快速療效，并分析其對Akt及mTOR分子的影響。方法成功建立產后抑郁子代模型后，隨機分組如下：正常子代組(CTL-F1，8只)，抑郁子代生理鹽水組(Veh，8只)、越鞠甘麥大棗湯組(YG，8只)。Veh組給予生理鹽水，YG組給予越鞠甘麥大棗湯(8.3 g·kg-1)。單次給藥24 h后測量強迫游泳實驗(FST)。取腦，Western blot法檢測小鼠海馬Akt及m-TOR的磷酸化及總體水平。結果YG組的游泳不動時間比Veh組明顯縮短(P<0.01)，并且小鼠海馬p-Akt和p-mTOR表達明顯上調(P<0.05)。結論越鞠甘麥大棗湯可能通過上調Akt和mTOR表達，快速緩解子代抑郁樣行為。

產后抑郁子代；越鞠甘麥大棗湯；Akt ；mTOR；快速抗抑郁；氯胺酮

母親患抑郁癥對于子女的生理心理發育有不良影響，尤其是母親的抑郁發病期在子女嬰幼兒早期，神經系統發育的關鍵期[1]。母親患抑郁癥導致其喂養消極，情感反應冷淡，形成子女早年的不良生活事件或應激，進而影響子女的生長發育水平，并使其更易形成神經精神疾病。Shrivastava等[2]的研究顯示，母親的抑郁癥對于兒童的行為異常、自殺觀念有重要影響，使兒童成年后更易患抑郁癥。Conron等[3]研究也指出，抑郁母親的子女更易行為異常，更易形成自殺觀念，并且抑郁癥首次發病年齡更早。抑郁母親的子女抑郁癥的發病率明顯增加。

目前常用的抗抑郁藥物主要通過增加腦內單胺類如5-羥色胺、去甲腎上腺素的濃度來發揮抗抑郁作用。這些抗抑郁藥物多起效緩慢，不良反應多，患者服藥依從性較差等。因而對于快速抗抑郁藥物的研究成為迫切的臨床需求。臨床研究結果顯示，氯胺酮是一種離子型谷氨酸能(ionotropic glutamatergic n-methyl-d-aspartate， NMDA)受體拮抗劑，能在短時間內明顯緩解抑郁癥狀[4]。進一步分子機制研究表明，蛋白激酶B(protein kinase B, 或 Akt)及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamcycin, mTOR)參與了氯胺酮的快速抗抑郁過程。氯胺酮激活Akt及mTOR，從而進一步促進神經可塑性變化，因而在動物模型上表現出明顯的抗抑郁作用[5]。我們前期的研究結果也顯示，越鞠甘麥大棗湯也可快速緩解動物模型的抑郁樣行為，與氯胺酮類似[6]。

本實驗基于前期夏寶妹等[6]的母代產后抑郁模型，進一步探究母代產后抑郁對子代抑郁癥發病的影響，觀察越鞠甘麥大棗湯對子代抑郁的作用，并且研究其對于小鼠海馬Akt及mTOR表達的影響，試圖解釋越鞠甘麥大棗湯快速緩解子代抑郁樣行為的機制，以期為快速抗抑郁藥物的研發提供參考。

1　材料

1.1實驗動物SPF清潔級健康Balb/c成年小鼠，體質量20 g～25 g，購買于軍事醫學科學院，動物合格證號：SCXK-(軍)2012-0004。動物房室溫(20～25)℃，濕度40%～70%，晝夜交替時間為12 h，動物可自由飲水進食。

1.2實驗藥物實驗用中藥材購于南京中醫藥大學國醫堂門診，經本校藥學院楊連云教授鑒定，為中國藥典收載品種。越鞠甘麥大棗湯由蒼術[Atractylodeslancea(Thunb.)DC.產自江蘇]100 g、香附(CyperusrotundusL.產自浙江)100 g、神曲(MassaMedicataFermentata.產自福建)100 g、梔子(GardeniajasminoidesEllis.產自湖南)100 g、川芎(LigusticumchuanxiongHort.產自四川)100 g、炙甘草(GlycyrrhizaeuralensisFisch.產自河北)125 g、淮小麥(TriticumaestivumL.產自河南)250 g、大棗(ZizyphusjujubeMill.產自四川)375 g組成，上述藥物加八倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h過濾，再加6倍量水按上法煎煮后過濾，合并兩次藥液，65℃減壓旋蒸濃縮，濃縮后的藥物終濃度為8.3 g·kg-1。配好的藥物分裝在10 mL離心管內，-20℃保存。本實驗所用中藥材由同一人員煎煮，煎煮時間，使用器具及煎煮方法固定，從而形成了固定的藥物提取流程。

1.3實驗儀器與試劑RE-852旋轉蒸發儀(南京金正教學儀器有限公司)；SB5200-型超聲清洗機(上海Branson公司)；Z-32臺式離心機(德國Hermle公司)；AE100電子天平(METTLER公司)；蛋白電泳及轉膜系統(Bio-Rad)；凝膠成像及分析系統(Tannon)。試劑：RIPA裂解液：Beyotime，貨號：P0013B；蛋白酶抑制劑Cocktail：Cell Signaling Technology，貨號：#5871S；蛋白Marker：貨號：00222891；一抗：均為兔抗小鼠，p-mTOR(Cell Signaling Technology，貨號：#2971S，1 ∶500)；mTOR(Cell Signaling Technology，貨號：#2983S，1 ∶500)；p-p70S6K(Cell Signaling Technology，貨號：#9234S，1 ∶500)；p70S6K(Cell Signaling Technology，貨號：#2708S，1 ∶1 000)；p-Akt(Abways，貨號：CY6569，1 ∶500)；Akt(proteintech，貨號：10176，1 ∶1 000)。β-tubulin (Epitomics，1879-1，1 ∶2 000)； 二抗：中杉金橋羊抗兔，批號：109525；ECL顯色液：康為世紀，批號：2514K。

2　方法

2.1抑郁母代模型的建立抑郁母代動物模型參照夏寶妹等[6]報道孕前應激造模法。具體如下：Balb/c成年♀鼠48只,隨機分為2組：對照組(24只)和孕前應激模型組(24只)。對照組不給予任何刺激，孕前應激組給予慢性應激：束縛(每天6 h)聯合24 h光照刺激(2次/周)，共刺激3周。應激結束后，與正常♂鼠合籠交配懷孕，并于分娩3周后檢測♀鼠行為學，以驗證抑郁母代造模成功。

2.2抑郁子代模型的形成與分組正常母代(CTL)與抑郁(PPD)母代所生的F1(第1代)與母代同籠至3周(斷奶)，按♀♂分籠，每籠6～8只。平均每籠選取同一出生時段的♂子代小鼠2只，形成正常子代組(CTL-F1，8只)，產后抑郁子代給予生理鹽水組(Veh，8只)及產后抑郁子代給予越鞠甘麥大棗湯組(YG，8只)。

2.3抑郁子代行為測量與給藥Veh組給予生理鹽水1次，YG組給予越鞠甘麥大棗湯1次，劑量為8.3 g·kg-1，濃度為10 mL·kg-1。于單次給藥24 h后測量強迫游泳實驗(forced swimming test，FST)，以觀察PPD-F1的抑郁表型以及越鞠甘麥大棗湯對抑郁子代行為的影響。所有動物均為單次給藥，由同一人員在同一時間點操作，以減少操作誤差。

2.4小鼠行為學測試(FST)將小鼠分別放入玻璃燒杯中，水溫保持在24℃～26℃。讓小鼠在其中游泳2 min后，立刻開始觀察記錄接下來4 min內小鼠總的不動時間：即小鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態，僅做微小動作以保持平衡。

2.5Western blotWestern blot法檢測Akt及m-TOR的磷酸化及總體水平。提取小鼠海馬蛋白，用Nanodrop測定樣品中的蛋白濃度。根據Akt及m-TOR的分子量選擇不同濃度的SDS-PAGE膠(Akt：10%膠；m-TOR：8%膠)來分離蛋白質，然后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，將PVDF膜放入一抗封閉緩沖液中，室溫下搖床輕柔震蕩1 h，然后分別加入p-Akt、Akt、p-mTOR、m-TOR及β-tubulin的抗體的孵育盒中，搖床上輕搖，4℃過夜。然后用TBST緩沖液漂洗3次，搖床劇烈震蕩，每次10 min。將洗滌后的PVDF膜放入加有羊抗兔二抗的抗體孵育盒中，室溫下孵育1 h。再于TBST緩沖液中洗滌3次，方法如前。最后用ECL顯影液顯影，采集p-Akt、Akt、p-mTOR、m-TOR及β-tubulin的條帶灰度值，得到各樣本蛋白的灰度比值。

3　結果

3.1越鞠甘麥大棗湯對抑郁子代強迫游泳行為的影響抑郁子代生理鹽水組強迫游泳不動時間明顯延長，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)；中藥越鞠甘麥大棗湯組的游泳不動時間明顯縮短(P<0.01)，與生理鹽水組相比差異有統計學意義(Fig 1)。

3.2越鞠甘麥大棗湯對小鼠海馬p-Akt表達的影響相對比對照組，抑郁子代生理鹽水組小鼠海馬中p-Akt表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)；而給中藥越鞠甘麥大棗湯后，小鼠海馬p-Akt表達明顯上調(P<0.05)，與生理鹽水組相比差異有統計學意義(Fig 2)。

3.3越鞠甘麥大棗湯對小鼠海馬p-mTOR表達的影響抑郁子代生理鹽水組小鼠海馬中p-mTOR表達與對照組相比明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)；而給中藥越鞠甘麥大棗湯后，小鼠海馬p-mTOR表達明顯上調(P<0.05)，與生理鹽水組相比差異有統計學意義(Fig 3)。

Fig 1　Immobility time of mice in forced swimming test 24 hours after administration

**P<0.01vsCTL-F1；##P<0.01vsVeh

Fig 2　p-Akt expression at 24h in hippocampus of mice

*P<0.05vsCTL-F1；#P<0.05vsVeh

4　討論

母代抑郁對子女產生的不良影響日益受到重視。有研究發現，約70%的母親抑郁可以持續到子女出生后的前6個月，而這些子女在1周歲時表現出生長發育緩慢[1]。母親患抑郁癥，影響其哺育行為，子女無法得到周全的照顧，這種來自母親的應激，更易導致子女神經發育遲緩，從而易患神經精神疾病。有研究顯示，抑郁母親的子女相比較正常子女更容易患抑郁癥[2,3,7]。本研究支持此觀點。結果顯示：母代抑郁的子代小鼠在強迫游泳上表現出不動時間延長，強迫游泳行為是反映小鼠的絕望行為，是抑郁樣行為表現的一個重要方面。

Fig 3　p-mTOR expression at 24 h in hippocampus of mice

*P<0.05vsCTL-F1；#P<0.05vsVeh

越鞠甘麥大棗湯是由越鞠丸和甘麥大棗湯組合而成。這兩者均為中醫治療情志異常的經典名方。周紅香等[8]報道合用越鞠丸和甘麥大棗湯加減可有效緩解產后抑郁癥患者的癥狀。另有臨床使用越鞠丸加減可治療卒中后抑郁[9]，而秦竹等[10]研究發現，甘麥大棗湯可緩解慢性不可預知模型下大鼠的抑郁樣表型。本研究合用二方，發現其可快速縮短抑郁子代小鼠的強迫游泳的不動時間，在緩解子代抑郁樣行為上表現出良好的效果，提示越鞠甘麥大棗湯具有快速抗抑郁潛力。這一結果與我們前期實驗結果相同。夏寶妹等[6]發現，越鞠甘麥大棗湯可快速緩解產后抑郁母代小鼠的抑郁樣表型，本研究結果發現其亦可逆轉抑郁子代的抑郁樣行為。

目前臨床上常用的抗抑郁藥物多為單胺增強類藥物，顯效時滯長，不利于患者的依從性，增加自殺傾向患者的風險。雖然這些藥物可在短時間內迅速增強單胺類，如5-羥色胺、去甲腎上腺素的濃度，但是患者的抑郁癥狀卻不能立即緩解。目前，對于抑郁癥的神經可塑性假說得到了更多的支持[11]。該假說認為抑郁癥是由情感相關腦區的神經可塑性對諸如應激壓力等不良適應造成的。抗抑郁治療引起神經信號傳導和細胞內特定基因及相關的突觸可塑性、神經營養因子和海馬神經新生等神經系統可塑性的改變，從而成為抗抑郁作用的微觀基礎。

低劑量的氯胺酮可快速持久緩解抑郁癥患者的癥狀，在動物實驗上也顯示了其良好的抗抑郁效果。分子機制研究發現，氯胺酮可快速激活Akt和mTOR等[5]，從而促進突觸可塑性[12]，與抗抑郁效果密切相關。mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它廣泛表達，功能主要受神經元表面受體和離子通道的活性影響，對于誘導和維持神經元長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression, LTD)有重要影響[13-15]，從而可能參與了記憶以及抑郁癥的過程。能影響mTOR表達的離子通道和受體包括NMDA受體以及腦源性神經營養因子(BDNF)等。同時，mTOR又是多種信號通路和受體的下游的交匯點，可受蛋白激酶B，也就是Akt激酶的影響[16]。mTOR通路參與蛋白質轉錄、翻譯、降解和自噬等多種過程，尤其對于突觸可塑性具有重要作用[17]。本研究中，越鞠甘麥大棗湯于給藥后24 h激活子代小鼠海馬Akt和mTOR，使表達上調，這一結果也與夏寶妹等[18]在產后抑郁母代上的觀察結果一致，提示了越鞠甘麥大棗湯可能通過激活Akt和mTOR，進一步促進突觸可塑性的改變，從而發揮了快速的抗抑郁作用。

本研究觀察了越鞠甘麥大棗湯對于產后抑郁子代的影響，并且進一步分析了其內在機制。我們已經觀察到越鞠甘麥大棗湯可快速降低產后抑郁子代小鼠的強迫游泳不動時間，并且可上調mTOR和Akt分子的表達，下一步應繼續分析其下游分子如S6K等的變化，進一步深入分析越鞠甘麥大棗湯發揮快速抗抑郁作用的機制，并為其臨床應用提供依據。(致謝：本研究在南京中醫藥大學基礎醫學院中醫腦病重點實驗室暨轉化系統生物學與神經科學研究中心完成，特此致謝！)

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Influence of Yuejuganmaidazao Decoction on depression-like behavior and m-TOR and Akt expression in hippocampus of PPD offspring

WU Ru-yan，LU Cai，TAO Wei-ei，XIA Bao-mei，XUE Wen-da，REN Li， WU Hao-xin，CHEN Gang

(KeyLaboratoryofIntegrativeBiomedicineforBrainDiseases,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210046,China)

AimTo observe the rapid antidepressant effect of Yuejuganmaidazao Decoction on postpatum depression offspring, and analyze its influence on the Akt and mTOR expression.MethodsAfter postpartum depression model was established, the offsprings were randomly divided into the following groups: control group(CTL-F1,n=8), vehicle group(Veh,n=8) and YG group(YG,n=8). Veh group was treated with vehicle, YG group was treated with Yueju ganmaidazao Decoction(8.3 g·kg-1). Forced swimming test(FST) was measured 24 hours after single administration. The phosphorylation and total level of Akt and m-TOR in the hippocampus was detected by Western blot.ResultsThe immobility time in YG group was significantly shorter than that in Veh group(P<0.01), and the expression of p-Akt and p-mTOR in the hippocampus was significantly increased(P<0.05).ConclusionYuejuganmaidazao Decoction may rapidly alleviate depression-like behaviors of PPD offsprings through upregulation of Akt and mTOR expression.

PPD offspring; Yueju ganmaidazao Decoction; Akt; mTOR; rapid antidepression；ketamine

◇復方藥物藥理學◇

2016-02-29,

2016-03-31

國家自然科學基金資助項目(No 81403041)；江蘇省高校優勢學科支持項目(No PAPD)；江蘇省自然基金資助項目(No BK 20151568)

吳如燕(1988-)，女，博士生，研究方向：中醫腦病學，E-mail：wuruyan0908@163.com;陳剛(1972-)，男，博士，特聘教授，博士生導師，研究方向：中醫腦病學，E-mail:chengang@njucm.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.026

A

1001-1978(2016)07-1022-05

R-332；R289.5；R322.81；R749.420.531；R971.43

網絡出版時間：2016-6-20 11:49網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.052.html