BestSeqTM技術在進行性肌營養不良癥基因突變檢測中的應用

李宗杰，宮璀璀△，金星星,代　穩

(1.鄭州大學第三附屬醫院科研中心　450000；2.中國人民解放軍第153中心醫院檢驗科，鄭州 450042；3.武警河南總隊醫院檢驗科，鄭州 450000)

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BestSeqTM技術在進行性肌營養不良癥基因突變檢測中的應用

李宗杰1,2，宮璀璀1,2△，金星星3,代穩2

(1.鄭州大學第三附屬醫院科研中心450000；2.中國人民解放軍第153中心醫院檢驗科，鄭州 450042；3.武警河南總隊醫院檢驗科，鄭州 450000)

摘要:目的應用BestSeqTM新一代致病基因檢測技術對進行性肌營養不良患者進行基因檢測，驗證該方法的敏感度和特異性。方法應用BestSeqTM新一代致病基因檢測技術，對2例肢帶型肌營養不良患者、6例杜氏肌營養不良患者進行基因測序，對發現的點突變應用Sanger測序進行驗證。結果研究完成了上述8例患者的基因檢測，共檢測出大片段缺失變異2個，微小突變10個，其中8個微小突變為首次發現的新突變，經Sanger測序驗證。結論BestSeqTM新一代致病基因檢測利用高密度疊瓦式探針及多重標簽技術大大提高了檢測效率，具有很好的臨床應用前景。

關鍵詞:進行性肌營養不良；基因檢測；微小突變

進行性肌營養不良(PMD)是一組異質性肌肉退化的遺傳性疾病，最常見的肌營養不良是Duchenne型肌營養不良(DMD)，其他肌營養不良包括肢帶型肌營養不良(LGMD)、Emery-Dreifuss肌營養不良(EDMD)等，目前尚無有效的根治方法，對個人、家庭和社會造成沉重的心理和經濟壓力[1-2]。近年來，隨著對遺傳性肌營養不良癥分子遺傳學研究的不斷深入，大大提高了疾病診斷的準確性。但由于遺傳性肌營養不良癥的基因龐大而復雜，存在著多種可變的剪接方式，自發突變率高。因此對于探索簡便、準確、快速、經濟的基因突變檢測技術就顯得尤為重要。本文應用BestSeqTM新一代致病基因檢測技術對遺傳性肌營養不良患者進行基因檢測，探索了BestSeqTM新一代致病基因檢測技術對遺傳性肌營養不良癥的診斷價值，為遺傳性肌營養不良癥的基因診斷和治療提供了實驗手段。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年5月至2015年9月在鄭州大學第三附屬醫院小兒科及神經內科門診就診，臨床擬診斷為進行性肌營養不良的8例患兒，家族史均陰性，其中6例擬診斷為杜氏肌營養不良患兒均有運動發育障礙，主要表現為搖曳步態，Gower′s征陽性，下肢病變早于上肢呈對稱性發展，下肢近心端肌肉萎縮明顯，肌肉活檢示不透明肌纖維交錯現象，細胞質內囊泡非邊緣分部，血清肌酸激酶(CK)水平明顯升高，提示肌營養不良性肌病。2例擬診斷肢帶型肌營養不良患者，表現為近端肌無力，肌腱反射減弱，累及骨盆及肩帶肌，CK水平明顯升高，病理檢查顯示營養不良性肌病。

1.2方法

1.2.1基因芯片捕獲和第二代基因測序提取患者gDNA，按試劑盒(QIAamp DNA blood Midi Kit Qiangen,Hilden,Germany)說明操作。二代測序gDNA建庫，取gDNA 1 μg經自適應高聚焦超聲(Covaris S2,Covaris公司)隨機打斷成200～300 bp的片段，用試劑盒(AMPure Kit，Agencourt公司)對片段樣本進行純化，應用T4聚合酶、T4PNK和大腸桿菌聚合酶Klenow片段進行DNA片段的末端修補及在3′端加A尾，通過Paird-end鏈接接頭反應建立文庫，以Illumina公司提供的與接頭相配套的引物進行擴增，并插入Index序列，利用Agilent(美國Agilent公司)SureDesign在線設計工具，設計針對目標基因外顯子及側翼序列(±10 bp)的靶向捕獲探針，定制專門的目標基因捕獲試劑盒，經雜交捕獲后，對捕獲后文庫進行LM-PCR擴增和純化，使用Agilent Bioanalyzer 2100儀器(美國Agilent公司)對測序文庫的DNA樣本進行檢測，再按照捕獲文庫DNA樣本濃度及測序深度要求，應用NEXTSEQ500測序儀(美國Illumina公司)上機測序。用Sanger法對患者樣本進行測序驗證。

1.2.2讀序原始結果生物信息學處理二代測序后產生的原始圖像經Illumina Pipeline軟件分析，作出評估和預判。通過質量控制，去除不可靠讀數，通過BWA比對軟件包將讀序比對至NCBI數據庫參考序列上，評估外顯子捕獲的情況。比對后結果應用SOAPsnp進行SNP分析，用GATK Indel Genotyper軟件發現目標區域的插入或缺失。將得到的突變信息與遺傳性疾病致病突變數據庫，如HGMD、UMD-DMD、the leiden open variation Datebase等及正常人群SNP數據庫，如NCBI dbSNP數據庫、HapMap數據庫、Genome 1000數據庫等進行關聯分析。用SIFT軟件通過對單氨基酸替換的改變進行功能預測，判斷其是否對蛋白質功能造成不良影響，預測結果還需要結合基因與臨床的關聯信息進行綜合分析判斷。

2結果

8例患兒均因出現運動發育障礙來院檢查，均發現有致病基因變異。在6例擬診斷為杜氏肌營養不良的患者中，有4例發現了致病基因DMD基因點突變，包括4個半合子變異(c.9739C>T；c.8038_8039insC；c.7217G>A；c.3532G>T)和1個內含子剪切變異(c.10785+10G>A)；2例發現大片段缺失(49～50號外顯子缺失變異；45～49號外顯子缺失變異)見表1、圖1。在2例擬診斷肢帶型肌營養不良的患者中，發現致病基因TTN基因2對復合雜合突變(c.42958A>G ，c.2310G>T ；c.53660G>A，c.25488T>G)，致病基因LMNA一個雜合突變(c.1490T>A)，見表1。上述變異中DMD基因c.9739C>T與c.3532G>T為已經報道的致病基因，其他變異均為首次發現新突變，例3中c.7217G>A為新生變異(De Novo)。

表1　　8例進行性肌營養不良患者致病基因變異情況

注：DMD為杜氏肌營養不良；LGMD為肢帶型肌營養不良。突變致病預測僅對未見報道基因預測，***表示未預測。-表示無數據。

注：例1為DMDc.9739C>T；例2為 DMDc.8038_8039insC；例3為DMD c.7217G>A；例4.1為DMD c.3532G>T，例4.2為c.10785+10G>A；例7.1為TTN c.42958A>G，例7.2為TTN c.2310G>T，例7.3為LMNA c.1490T>A；例8.1為 c.53660G>A；例8.2 c.25488T>G。

圖1進行性肌營養不良突變位點二代測序圖

3討論

遺傳性肌營養不良癥是一組主要累及骨骼肌系統的遺傳性單基因病，其臨床表現復雜，病情輕重懸殊，具有高度的臨床異質性。如：Duchenne型(DMD)臨床特點為發病早(3歲左右)，進展快，起病后10年左右即失去行走能力，預后極差，多于20歲前死于呼吸衰竭、心力衰竭或呼吸道感染；又如Emery-Dreifuss型，早期出現肘關節、頸椎攣縮，有心肌傳導障礙，病情進展慢，預后相對較好，可存活至老年[3]。

遺傳性肌營養不良癥根據近幾年來分子遺傳學、免疫組織化學及超微病理學的研究結果發現，所涉及的致病基因位點眾多，相同基因位點或不同基因位點所引起的臨床癥狀可差異懸殊或極為相似，具有高度的基因異質性。本研究完成了8例患者的遺傳性肌肉病125個基因檢測包的基因測序，共發現了10個微小突變，2個片段缺失突變。在肢帶型肌營養不良家系中，例7的TTN基因新發現c.42958A>G、c.2310G>T的復合雜合核苷酸變異，上述變異分別導致第14 320號氨基酸由Lys變為Glu(p.Lys14 320Glu)、第770號氨基酸由Gln變為His(p.Gln770His)，均為錯義變異。受檢者其父在位點c.2310發現G>T的雜合變異，其母該位點未見異常；受檢者其母在位點c.42958發現A>G的雜合變異，其父該位點未見異常。另外，例7還伴有致病基因LMNA一個雜合新突變(c.1490T>A)，該變異導致第497號氨基酸由Ile變為Asn(p.Ile497Asn)，為錯義變異。

在肢帶型肌營養不良家系的例8中，新發現了致病基因TTN的2對復合雜合突變(c.53660G>A，c.25488T>G)，2對變異分別導致第17887號氨基酸由Arg變為His(p.Arg17887His)，第8496號氨基酸由Ile變為Met(p.Ile8496Met)，均為錯義變異。受檢者其父在位點c.53660發現G>A的雜合變異，其母該位點未見異常；受檢者其母在位點c.25488發現T>G的雜合變異，其父該位點未見異常。TTN基因是肢帶型肌營養不良2J型(Muscular dystrophy,limb-girdle,type 2J)的致病基因，為常染色體隱性遺傳方式(AR)。對于該類遺傳方式，復合雜合變異可能導致發病。在患者TTN基因所發現的復合雜合變異分別遺傳自受檢者其父母，父母均為雜合子，符合常染色體隱性遺傳方式。

在杜氏肌營養不良例1患者的DMD基因發現c.9739C>T的核苷酸變異，該變異導致編譯第3247號氨基酸Gln的密碼子變為終止密碼子p.Gln3247Ter)，為無義變異。該變異的致病性已有文獻報道[4]，與杜氏肌營養不良相關，該變異不屬于多態性變化，在人群中發生的頻率極低。其母為雜合子，符合X連鎖隱性遺傳方式。

在例2患者的DMD基因發現新的c.8038_8039insC的核苷酸變異，該變異導致從第2680號氨基酸Arg開始的氨基酸合成發生改變(p.Arg2680fs)，為移碼變異。該變異可能導致蛋白質功能受到影響。受檢者其父該位點未見異常，其母該位點為雜合子。但與該變異同一位置變異c.8038C>T的致病性已經文獻報道[5]。DMD基因是杜氏/貝氏肌營養不良(DMD/BMD)的致病基因，為X連鎖隱性遺傳方式(XR)。對于該類遺傳方式，所發現的變異可能導致發病。

例3患者發現c.7217G>A的核苷酸變異，該變異導致編譯第2406號氨基酸Trp的密碼子變為終止密碼子(p.Trp2406Ter)，從而使肽鏈合成提前終止，為無義變異。患者父母DMD基因均未發現上述變異，該變異為新生變異(De Novo)。

例4患者發現c.10785+10G>A的剪切變異和c.3532G>T的無義變異。其父上述位點均未見異常，其母上述位點均為雜合子。變異c.10785+10G>A的致病性尚未見文獻報道，變異c.3532G>T的致病性已經文獻報道，與杜氏肌營養不良相關[6]，上述變異均不屬于多態性變化，在人群中發生的頻率極低。

例5和例6患者發現大片段缺失，分別發生49～50號外顯子缺失變異和45～49號外顯子缺失變異，這與文獻報道的突變區域相符，中央熱區位于44～51號外顯子，占70%[7-8]。例6患者的母親和姐姐DMD基因檢測也存在同樣的45～49號外顯子的缺失變異，其母和姐姐很可能均為致病變異攜帶者。DMD病歷中散發病例較多，它可能是因為：(1)隱匿傳遞的致病基因的“暴露”；(2)母親卵細胞減數分裂的“差錯”；(3)母親生殖腺細胞有絲分裂差錯，卵巢中有相當一部分卵母細胞攜帶變異基因，即“生殖腺嵌合”。

雖然現在已將基因測序檢測列入遺傳性肌營養不良的診斷指標之一,但目前所用的檢測方法還存在許多不盡人意的地方。在準確率方面，Sanger測序法是世界公認的最準確的檢測方法，可以達到100%。但由于Sanger測序法測序流程復雜，對于沒有明確候選基因和候選基因數目較大的大樣本病例篩查是難以完成的。另外，此法不能檢測出大片段缺失或拷貝數變異等基因突變類型對于與此相關的遺傳性疾病還不能做出基因學診斷。

BestSeqTM是在第二代基因測序的基礎上研發的新一代致病基因檢測技術。在樣品制備階段，應用具有實用新型專利的獨特技術設計的樣品制備試劑盒，根據致病基因突變特點及序列特征，結合本實驗室自主研發的探針優化設計方案，在試劑盒內設計了獨特的高密度特異性捕獲探針，保證了高精度、高準確率的定點靶向捕獲；提高樣品捕獲通量通過獨特的多重標簽技術，給每個待檢樣品打上了“條形碼”，可以準確穩定的一次捕獲多個樣品的全部待檢基因。利用這一技術創新，與世界同類技術如SMRT測序方法相比，BestSeqTM致病基因檢測技術可以在相同的時間能夠準備最多的待檢樣品；對手工操作過程建立了標準化質量控制程序，有效保障檢驗質量的穩定性和可重復性，結合獨特的高密度疊瓦式探針及多重標簽技術可以將高通量測序平臺的數據通量大優勢發揮到極致，大大提高檢測效率，可以達到一次上機同時檢測300個樣品，平均測序深度可以達到200X，目標捕獲能力可以達到99.9%，測序精確度可以達到99.99%，而成本大大降低；同時，使用該技術，對每一個樣本最多可以做到同時完成對100余種疾病的所有已知致病基因的全部位點(約50萬個位點)的檢測。從而使BestSeqTM致病基因檢測技術成為一項可以應用于臨床檢驗的穩定、高效的標準化檢測技術。

綜上所述，BestSeqTM致病基因檢測技術具有很好的準確性、經濟性和高效性。

參考文獻

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作者簡介：李宗杰，男，主管檢驗技師，主要從事臨床檢驗研究。 △通訊作者，E-mail：gongcuijin@yahoo.com.cn。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.013

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1933-03

(收稿日期：2016-02-17修回日期：2016-04-28)

Application of BestSeqTMtechnology in the genetic mutation detection of progressive muscular dystrophy

LIZongjie1,2,GONGCuicui1,2△,JINXingxing3,DAIWen2

(1.ScientificResearchCenter,ThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou，Henan450000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,153HospitalofPLA,Zhengzhou,Henan450042,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,.GeneralHospitalofHenanArmedPoliceCorps,Zhengzhou,Henan450000,China)

Abstract:ObjectiveTo apply the BestSeqTMnew generation pathogenic gene detection technology to perform the genetic detection in the patients with progressive muscular dystrophy(PMD) validating its sensitivity and specificity.MethodsThe BestSeqTMnew generation pathogenic gene detection technology was used to perform the gene sequencing in 2 cases of limb-girdle muscular dystrophy(LGMD) and 6 cases of Dunchenne′s muscular dystrophy(DMD),and the found point mutations were confirmed by the Sanger sequencing method.ResultsThis study completed the genetic detection in above 8 cases,2 cases of large fragment deletion and 10 cases of micromutations were detected,in which 8 micromutations were the new mutation discovered ffor the first time and verified by the Sanger sequencing.ConclusionThe BestSeqTMnew generation pathogenic gene detection technology greatly increases the detection efficiency by using the high density imbricate type probe and multiple tag technology,and has the better clinical application prospects.

Key words:progressive muscular dystrophy;genetic testing;micromutation