棘白菌素對念珠菌體外藥敏試驗產生“矛盾現象”的分析

曾　吉，金　策，黃舟瑩，李　辰，王瑞琦

(1.湖北省武漢市普愛醫院檢驗科　430033；2.華中科技大學同濟醫學院醫學檢驗系，武漢430031)

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棘白菌素對念珠菌體外藥敏試驗產生“矛盾現象”的分析

曾吉1，金策1，黃舟瑩2，李辰2，王瑞琦2

(1.湖北省武漢市普愛醫院檢驗科430033；2.華中科技大學同濟醫學院醫學檢驗系，武漢430031)

摘要:目的觀察棘白菌素對念珠菌的“矛盾現象”。方法體外藥敏試驗中，采用微量稀釋法分別觀察卡泊芬凈和米卡芬凈對180株念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)和“矛盾現象”。結果卡泊芬凈對白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌均產生“矛盾現象”，發生率分別為66.0%、77.5%、55.0%和35.0%，各菌矛盾現象的起點/終點中位數濃度分別為8/32、16/32、8/32、4/16 μg/mL；米卡芬凈只對白色念珠菌和熱帶念珠菌產生“矛盾現象”，發生率分別為45%和67.5%，各菌矛盾現象的起點/終點中位數濃度分別為4/16、8/32 μg/mL。結論“矛盾現象”的產生存在念珠菌種間差異性和棘白菌素類藥物特異性。卡泊芬凈出現“矛盾現象”的發生率高于米卡芬凈。各菌株對卡泊芬凈、米卡芬凈產生“矛盾現象”的發生率與MIC的高低無明顯相關性。

關鍵詞:念珠菌；卡泊芬凈；米卡芬凈；矛盾現象

棘白菌素是一類新型的抗真菌藥物,能非競爭性抑制真菌細胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶,造成真菌細胞壁中β-葡聚糖減少，引起細胞結構破壞，有較高的特異性,能迅速殺滅真菌[1]。因為哺乳類動物的細胞中不存在β-1,3-D-葡聚糖合成酶,故該類化合物對人體正常細胞影響不大。作為一種新型抗真菌藥物,棘白菌素類抗真菌藥已在臨床逐步推廣應用[2]。目前國內外均有試驗發現進行體外藥敏試驗棘白菌素作用于念珠菌屬會出現低濃度時抑制、高濃度時出現菌落生長的“矛盾現象”[3]。目前此現象和臨床關系尚未明確。已有研究通過對不同念珠菌種對卡泊芬凈、米卡芬凈體外藥敏試驗出現“矛盾現象”的動態觀察，念珠菌屬對卡泊芬凈、米卡芬凈的體外藥敏試驗有可能出現“矛盾現象”，并具有一定的對應關系[4]。本研究通過微量稀釋法驗證了“矛盾現象”的存在，并初步探討了“矛盾效應”的發生率。

1材料與方法

1.1材料菌株：收集武漢地區從臨床患者分離的念珠菌共180株，包括白色念珠菌100株、熱帶念珠菌40株、近平滑念珠菌20株、光滑念珠菌20株。使用近平滑念珠菌ATCC22019作為質控菌株。

1.2儀器與試劑卡泊芬凈(美國Merck公司)，米卡芬凈(日本Fujisawa公司)。RPMI1640(干粉裝，Sigma)，MOPS緩沖液(干粉裝，Sangon)。

1.3方法

1.3.1真菌接種液制備各受試念珠菌株先在沙氏培養基上轉種2 次，再經24 h培養后，選擇直徑大于1 mm的菌落5個，將其用0.85%的無菌鹽水制成懸液。用牛鮑計數板計數孢子，調整含菌量，使集落形成單位(CFU)為(1～5)×106/mL，待用。

1.3.2最低抑菌濃度(MIC)和“矛盾效應”的測量參考CLSI M27-A3文件推薦的微量液基稀釋法的規范[5]，本研究依據實際情況作出修改，藥物濃度梯度設計為0.03～64.00 μg/mL,共12組濃度梯度。往已稀釋好的含有不同藥液的微孔中加入待測菌液，使真菌接種液最終CFU調至(0.5～2.5)×103/mL。最終96孔板每孔體積為200 μL，35 ℃培養48 h。

1.3.3結果判定48 h后肉眼觀察結果，肉眼判讀MIC和“矛盾效應”的起始濃度和終止濃度。在高于MIC 2倍稀釋濃度以上出現菌落生長的情況判定為“矛盾現象”。

2結果

卡泊芬凈和米卡芬凈白色念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌的MIC90都比較低，沒有發現耐藥株，對近平滑念珠菌的MIC較高，MIC50、MIC90分別為1.00、2.00 μg/mL。卡泊芬凈對這4種念珠菌均有“矛盾現象”出現，米卡芬凈只對白色念珠菌和熱帶念珠菌有“矛盾現象”出現。卡泊芬凈對念珠菌“矛盾現象”起點濃度中位數較米卡芬凈高，見表1。

表1　　念珠菌對卡泊芬凈、米卡芬凈出現 “矛盾現象”

注：-表示未檢測。

3討論

本研究測定了卡泊芬凈和米卡芬凈對念珠菌的MIC，結果顯示卡泊芬凈和米卡芬凈對白色念珠菌和熱帶念珠菌的MIC90/MIC50均分別為0.13/0.25 μg/mL和0.03/0.03 μg/mL，對光滑念珠菌分別為0.03/0.03 μg/mL和0.03/0.25 μg/mL，與Macro等[6]、Pfaller等[7]、曾榮等[8]報道相似。卡泊芬凈和米卡芬凈對近平滑念珠菌的 MIC90/MIC50為1.00/0.50 μg/mL和2.00/1.00 μg/mL。本研究結果表明，棘白菌素類藥物卡泊芬凈、米卡芬凈對念珠菌總體有較好的抗菌作用，其中對白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌的MIC值較低，對近平滑念珠菌的MIC值相對其他3種念珠菌高。

本研究證實了棘白菌素對念珠菌“矛盾現象”的存在，卡泊芬凈較米卡芬凈更易出現“矛盾現象”。本研究中，所有念珠菌在卡泊芬凈作用下均出現該現象，且發生率遠高于米卡芬凈。對比MIC濃度和“矛盾現象”起點/終點濃度發現兩者無明顯相關性。本研究中，“矛盾現象”的發生率與曾榮等[8]研究結果相似，但顯著高于Fleischhacker等[9]報道的結果，出現差異可能與實驗的樣本量較小、菌種來源不同等多種因素有關。

本研究發現，“矛盾現象”發生率的變化存在念珠菌種屬差異性和棘白菌素類藥物特異性，而且與藥物作用時間有一定的關系。卡泊芬凈“矛盾現象”發生率的變化情況較米卡芬凈更加明顯，且發生率更高。一定時間內“矛盾現象”的發生率會隨藥物作用時間增加而有所增加。目前，“矛盾現象”的原因尚無定論。有觀點認為“矛盾現象”是念珠菌在高濃度棘白菌素類藥物作用時產生的一種自身保護性代償機制，其通過改變細胞壁組分而免受藥物殺傷。其產生機制目前還未完全闡明，可能的機制有念珠菌細胞壁幾丁質含量升高、細胞壁蛋白激酶C(PKC)途徑等[10-12]。

本研究結果表明，念珠菌屬對卡泊芬凈、米卡芬凈的體外藥敏試驗有可能出現“矛盾現象”，其與藥物特異性有關，并和藥物作用時間有一定的對應關系，但其發生率無確定參考范圍。不同念珠菌種的“矛盾現象”出現的時間、起點/終點不一，同一菌種不同菌株之間也存在差異。

參考文獻

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.046

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-2008-02

(收稿日期：2016-01-17修回日期：2016-03-19)