CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞在牛奶蛋白過敏發生及耐受中的作用

楊希晨，劉　靜，華亞軍

(東南大學醫學院附屬江陰市人民醫院兒科，江蘇 江陰 214400)

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【醫學薈萃】

CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞在牛奶蛋白過敏發生及耐受中的作用

楊希晨，劉靜，華亞軍

(東南大學醫學院附屬江陰市人民醫院兒科，江蘇 江陰 214400)

[摘要]目的探討CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞在牛奶蛋白過敏患兒發病及耐受過程中的作用。方法選取2013年1月至2015年1月東南大學醫學院附屬江陰市人民醫院兒科明確診斷牛奶蛋白過敏的患兒20例，健康對照組20例，牛奶蛋白過敏患兒予深度水解或完全水解蛋白配方粉喂養6個月，6個月后行食物激發試驗，過敏耐受者15例，耐受失敗者3例。治療前后測定外周血CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞的水平，分析比較牛奶蛋白過敏患兒治療前、治療后及與對照組之間CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞的差異，并比較治療后過敏耐受患兒和耐受失敗患兒CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞的差異。結果牛奶蛋白過敏患兒CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞水平明顯低于對照組患兒(3.73±0.42% vs 6.90±0.35%，t=2.22，P<0.05)；治療后CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞水平較治療前明顯升高(5.18±0.81% vs 3.73±0.42%，t=2.10，P<0.05)；治療后牛奶蛋白耐受患兒CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞水平明顯高于耐受失敗患兒(5.36±0.76% vs 4.28±0.36%，t=2.31，P<0.05)。結論CD4+CD25+FOXP3+ 調節性T細胞有助于減少牛奶蛋白過敏的發生，并幫助誘導免疫耐受。

[關鍵詞]牛奶蛋白過敏；CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞；兒童；免疫耐受

近年來，隨著生活方式及環境的改變，過敏性疾病發病率逐年提高。牛奶蛋白過敏是嬰兒最常見的過敏性疾病，在歐美發達國家，嬰兒牛奶過敏發生率為1.2%～17%[1]。我國目前無確切的統計學數據，但臨床發現該類疾病患兒越來越多，對兒童的生活質量及生長發育有嚴重影響。

牛奶蛋白過敏(cow’s milk allergy, CMA)的發病復雜，多種免疫細胞、活性因子參與調控，機制尚不完全清楚。近年來多方面動物實驗研究提示調節性T細胞(regulatory T cells, Treg細胞)尤其是表達FOXP3的調節性T細胞在過敏反應的發生及過敏耐受過程中有重要作用[2-3]。本文通過檢測牛奶蛋白過敏患兒發病時及耐受后外周血CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞(CD4+CD25+FOXP3+Treg)的水平，說明CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞在該病發病及耐受過程中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年1月至2015年1月江陰市人民醫院兒科門診及病房臨床擬診為牛奶蛋白過敏患兒25例，診斷基本符合2009年11月中華醫學會兒科學分會免疫學組《中華兒科雜志》編輯委員會提出的《嬰兒過敏性疾病預防、診斷和治療專家共識》[4]，并排除其他過敏性疾病可能。擬診牛奶蛋白過敏的患兒回避完整的牛奶蛋白飲食，予深度水解或完全水解蛋白配方粉喂養2周，癥狀無改善者剔除實驗組。癥狀改善或消失者行診斷性食物激發試驗(1周時間觀察)，如癥狀反復，激發試驗陽性，則明確診斷為牛奶蛋白過敏患兒，并納入實驗組，共20例，其中男12例，女8例，平均月齡4.09±2.10。其他5例剔除實驗組，考慮其他診斷。隨訪20例明確診斷牛奶蛋白過敏患兒6個月，2名患兒治療過程中失訪，其他18名兒童6個月后再次行食物激發試驗，試驗陰性為過敏耐受，共15例，試驗陽性考慮耐受失敗，共3例。

健康對照組20例，均為本院同期體檢的健康嬰兒，無過敏性疾病病史及家族史，無急慢性疾病，生長發育良好，男10例，女10例，平均月齡4.86±2.29，與實驗組在性別分布、年齡上均無明顯差異(χ2=0.43，P>0.05；t=1.125，P>0.05)。

1.2方法

CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞水平測定：所有參與研究嬰兒均清晨6:00空腹采取靜脈EDTA抗凝血2mL，EDTA抗凝靜脈血以淋巴細胞分離液常規分離外周血單個核細胞，采用CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞試劑盒(購自美國eBbioscience公司)及流式細胞術測定(FACScan流式細胞儀，美國BD公司)CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞在CD4+T細胞中的百分比。

1.3統計學方法

流式數據以CD4+CD25+FOXP3+T淋巴細胞在CD4+T淋巴細胞中的百分比表示。運用SPSS 13.0統計學軟件分析數據，t檢驗兩組均數的差異，卡方檢驗比較兩組率的差異，其中以P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1臨床表現

20例明確診斷牛奶蛋白過敏患兒中8例患兒有明確的過敏性家族史，14例有濕疹的表現，8例表現為消化道癥狀，其中3例有嘔血，4例有便血，多為大便含血絲。治療隨訪6個月后2名患兒失訪，余患兒消化道癥狀均消失，濕疹情況明顯改善，其中12例濕疹癥狀消失，僅2例患兒仍有輕度的濕疹反復。該18例患兒中無喘息、過敏性休克及營養不良病例。

2.2實驗組治療前、治療后及與對照組之間CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞數量比較

實驗組治療前與對照組相比有顯著性差異(t=2.22，P=0.042)；實驗組治療前后相比有顯著性差異(t=2.10，P=0.048)，見表1。

2.3耐受組與耐受失敗組患兒在治療后CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞數量比較

實驗組治療后6個月行食物激發試驗，其中過敏耐受者15例，耐受失敗者3例。過敏耐受組與耐受失敗組外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg數量比較存在顯著性差異(t=2.31，P=0.031)，見表2。

Table 1　Comparison of the level of CD4+CD25+FOXP3+　regulatory T cells in peripheral blood among children in different ±S)

Table 2　Comparison of the level of CD4+CD25+FOXP3+ 　regulatory T cells in peripheral blood after treatment among children in different groups ±S)

3討論

3.1牛奶蛋白過敏

過敏性疾病發病率呈全球性增長趨勢，已成為新世紀的流行病，是全球性健康問題。食物過敏是一種多因素、多系統參與的由遺傳背景和環境因素共同作用導致的復雜疾病，是一種較常見的變應性疾病[1]。牛奶是嬰兒除母乳以外最早接觸的食物，因此牛奶蛋白過敏為嬰幼兒最常見也是最早出現的食物過敏，臨床表現可累及多個系統，表現多種多樣，累及消化系統表現為：嘔吐、腹瀉、胃食道反流、便血、便秘；累及皮膚表現為蕁麻疹、濕疹、面部、口唇、眼瞼水腫，重者可表現為缺鐵性貧血、生長發育落后、低蛋白血癥，影響患兒的生長發育。本研究中亦發現牛奶蛋白過敏多發病于小嬰兒，以濕疹癥狀最為常見，其次為消化道癥狀，通過食物回避后消化道癥狀及皮膚表現均可明顯改善，與以往研究一致[5]。

3.2治療前后不同組中CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞水平差異意義及作用機制

本研究提示，牛奶蛋白過敏組患兒治療前外周血中CD4+CD25+FOXP3+Tregs數量明顯少于對照組患兒，治療后外周血中CD4+CD25+FOXP3+Tregs數量較治療前升高，6個月后牛奶蛋白耐受失敗患兒體內CD4+CD25+FOXP3+Treg明顯少于耐受成功患兒，證實CD4+CD25+FOXP3+Tregs有助于減少過敏的發生，并幫助誘導免疫耐受，提示CD4+CD25+Treg與過敏性疾病及免疫耐受存在相關性，提示CD4+CD25+Treg可通過抑制效應T細胞來誘導口服耐受，實現對免疫應答的負調節。

既往的體外實驗表明外周和腸道局部的CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cells，Treg 細胞)在形成食物耐受中發揮重要作用[2]。CD4+CD25+Treg是胸腺產生的功能成熟的T細胞亞群，約占外周血CD4+T細胞的5%～10%，是Treg細胞的主要組成部分。CD4+CD25+調節性T細胞具有免疫無能性，在接受抗原刺激后既不增生也無白細胞介素-2(IL-2)分泌等T細胞活化現象；同時，CD4+CD25+Treg具有免疫抑制性，可抑制其他CD4+和CD8+T細胞亞群及B細胞的活化和細胞因子的分泌。其通用細胞間接觸性抑制、分泌細胞因子、旁觀者效應等方式發揮免疫抑制效應[6]。其中轉錄因子Foxp3是CD4+CD25+調節性T細胞發育和功能維持的關鍵性調節基因，其對于其他調節性T細胞的發育也有著重要的作用。Foxp3基因缺失使CD4+CD25+Tregs抑制活性消失，而Foxp3在CD25+Treg異位表達則可恢復抑制活性。Foxp3基因突變小鼠出現高過敏狀態，提示調節性T細胞數目或功能異常可能在過敏的發病中起到一定的作用[7]。

3.3其他過敏性疾病中的CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞

CD4+CD25+FOXP3+Tregs除了在食物過敏的發生及耐受過程中起到重要作用以外，在其他過敏性疾病中亦發揮著重要作用。2007年Hartl等的研究表明哮喘兒童肺泡灌洗液中CD4+CD25+Treg值是下降的，其吸入糖皮質激素與外周血和肺泡灌洗液中CD4+CD25+Treg比例上升有相關性。另外國內王煒等2013年研究發現哮喘急性發作期患兒CD4+CD25+Treg的數量、Foxp3基因表達與緩解期的兒童相比，數量減少，表達降低，提示調節性T細胞數量減少及分化障礙可能在兒童哮喘的發病中亦起重要作用。

綜上所述，CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞在牛奶蛋白過敏患兒的發病及過敏耐受過程中有著重要作用，它有助于減少過敏的發生，并幫助誘導免疫耐受，但具體的免疫調節機制尚有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1]Umasunthar T, Leonardi-Bee J, Turner P J,etal. Incidence of food anaphylaxis in people with food allergy: a systematic review and meta-analysis [J]. Clin Exp Allergy, 2015,45(11):1621-1636.

[2]Van den Elsen L W, Meulenbroek L A, van Esch B C,etal.CD25+regulatory T cells transfer n-3 long chain polyunsaturated fatty acids-induced tolerance in mice allergic to cow’s milk protein [J].Allergy,2013,68(12):1562-1570.

[3]Barletta B, Rossi G, Schiavi E,etal.Probiotic VSL#3-induced TGF-β ameliorates food allergy inflammation in a mouse model of peanut sensitization through the induction of regulatory T cells in the gut mucosa[J]. Mol Nutr Food Res, 2013,57(12):2233-2244.

[4]中華醫學會兒科分會免疫學組.嬰兒過敏性疾病預防、診斷和治療專家共識[J].中華兒科雜志,2009,47(11):835-838.

[5]鄭玉燦,金玉,李玫,等.游離氨基酸配方奶粉在牛奶蛋白過敏患兒中的應用[J].實用兒科臨床雜志,2012,27(19):1488-1490.

[6]Palomares O.The role of regulatory T cells in IgE-mediated food allergy[J].J Investig Allergol Clin Immunol,2013,23(6):371-382.

[7]Sakaguchi S.Regulatory T cells: history and perspective[J].Methods Mol Biol,2011,707:3-17.

[專業責任編輯：史曉薇]

[收稿日期]2015-12-30

[作者簡介]楊希晨(1983-)，女，主治醫師，碩士研究生，主要從事兒童消化系統疾病及兒童重癥診療工作。

[通訊作者]華亞軍，主任醫師。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.07.024

[中圖分類號]R725.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5293(2016)07-0859-02

Roles of CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells in pathogenesis and tolerance for cow’s milk allergy

YANG Xi-chen, LIU Jing, HUA Ya-jun

(Department of Pediatrics, Jiangyin People’s Hospital Affiliated to Southeast University Medical College,Jiangsu Jiangyin 214400, China)

[Abstract]Objective To explore the roles of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in the pathogenesis of and tolerance induction against cow’s milk allergy. Methods A total of 20 children who were allergic to cow’s milk were chosen as research objects. All these children were diagnosed at the department of pediatrics in Jiangyin People’s Hospital Affiliated to Southeast University Medical College from January 2013 to January 2015. Over the same period, 20 healthy children were selected in control group. Children with cow’s milk allergy were given completely hydrolyzed or deeply hydrolyzed protein formulas for six months. Six months later, a food challenge test was performed. Among them, 15 children were tolerant to cow’s milk while 3 children were not. Levels of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in peripheral blood were measured before and after treatment. Besides, comparison of the CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in children with cow’s milk allergy before and after the treatment was carried out. In addition, intergroup comparison of the CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells was conducted. Moreover, comparison of the CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells was also performed between children who developed tolerance to cow’s milk and who were still allergic to cow’s milk. Results The level of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells was significantly lower in children with cow’s milk allergy than the control group (3.73±0.42% vs 6.9±0.35%, t=2.22, P<0.05). After treatment, a remarkable increase was identified in the level of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells when compared with the situation before treatment (5.18±0.81% vs 3.73±0.42%, t=2.10, P<0.05). After treatment, the level of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells was significantly higher in children who developed tolerance to cow’s milk than those who were still allergic to cow’s milk (5.36±0.76% vs 4.28±0.36%,t=2.31,P<0.05).Conclusion CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells can help to reduce the incidence of allergy to cow’s milk protein and help to trigger immune tolerance.

[Key words]cow’s milk allergy; CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells; children; immune tolerance