淀粉類酶降解烤煙中淀粉的研究

羅　丹，吳　俊，全學軍，戴　亞，馬擴彥

(1.重慶理工大學 化學化工學院，重慶　400054；2.重慶中煙工業有限責任公司，重慶　400062)

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淀粉類酶降解烤煙中淀粉的研究

羅丹1，吳俊1，全學軍1，戴亞2，馬擴彥2

(1.重慶理工大學 化學化工學院，重慶400054；2.重慶中煙工業有限責任公司，重慶400062)

摘要：以云煙85為原料，為降低烤煙中淀粉含量，研究了外加α-淀粉酶和糖化酶對淀粉降解的影響。結果表明：外加淀粉類酶能有效降低烤煙中的淀粉含量。未處理前云煙85直鏈淀粉含量約為1.42%，支鏈淀粉約為2.67%。淀粉類酶混合液處理8 h后，直鏈淀粉減少了約34.5%，支鏈淀粉減少了約66.7%。采用掃描電鏡對原樣、緩沖液處理樣品以及淀粉類酶處理樣品進行了觀察分析，結果表明：酶處理前后煙葉組織結構有較大變化，酶處理之后煙葉組織結構由于淀粉降解而出現塌陷現象，從而呈現大面積的凹凸不平區域。

關鍵詞：煙草;淀粉；淀粉類酶；表面微結構

淀粉是煙草生長過程中積累的重要碳水化合物，廣泛存在于煙草的莖葉中。新鮮煙葉經過調制，大部分淀粉降解為還原糖，但處理后的煙葉仍殘留一定量的淀粉。一些研究表明[1-3]：煙葉中淀粉含量較高將會影響燃吸速度，產生較多有害成分，對煙草的色、香、味產生不良影響。近年來，我國烤煙水平不斷提高，但與進口煙相比在其內在的化學組成協調性等方面還存在著較大差異。目前，我國烤煙中淀粉含量(質量分數)約為4%～6%，而國外優質烤煙淀粉含量僅為1%～2%[4]。因此，進一步研究降解烤煙中的淀粉，對提高我國煙草產品品質具有重要的意義。

近年來，利用外加酶制劑降低煙葉中的淀粉，以提高煙葉的品質已成為煙葉發酵研究的熱點。煙草在烘烤過程中外加淀粉類酶能有效降解煙草中淀粉，向烤后煙葉中加入一定量的糖化酶和α-淀粉酶，能有效將淀粉降解為水溶性糖[5-7]。然而，大多數研究只考察了糖化酶和α-淀粉酶對煙草總淀粉的降解情況，而沒有對糖化酶和α-淀粉酶處理之后的煙葉中淀粉組成以及煙草組織結構的變化情況進行研究。本研究采用高氯酸超聲提取淀粉[8]結合雙波長法[9-10]測定了淀粉類酶處理前后煙葉中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量，并考察了淀粉類酶處理前后煙葉組織結構的變化情況。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

云煙85烤煙葉C3F， 2012年產于四川涼山州西昌市，由重慶中煙工業有限責任公司提供；直鏈淀粉和支鏈淀粉標準樣品，美國Sigma公司出品；α-淀粉酶(活力為30μg/mg)和糖化酶(活力為120μg/mg)，美國Sigma公司出品；無水乙醇、氯化鈉、高氯酸、氫氧化鈉、碘、碘化鉀，成都市科龍化工試劑廠生產。

電子分析天平，感量為0.000 1g，梅特勒-托利多儀器上海有限公司出品；超聲清洗器(KQ-400KDE)，昆山市超聲儀器有限公司生產；精密酸度計(pH-3S)，南京桑力電子廠生產；雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901)，北京普析通用儀器有限責任公司生產；掃描電鏡(JSM-6460LV)，日本電子株式會社生產。

1.2方法

1.2.1樣品預處理

配制NaH2PO4·2H2O緩沖溶液，添加70mg/L的Ca2+濃度，調節pH值至5.45。加入淀粉類酶，配制成12μg/mL的a-淀粉酶溶液和48μg/mL糖化酶溶液[11-12]。以煙葉質量為基準，加入量為α-淀粉酶15μg/g、糖化酶150μg/g，在55℃恒溫水浴鍋中恒溫一定時間，取處理之后煙葉清水沖洗，40 ℃烘干，再進行淀粉含量測定及電鏡掃描。

1.2.2淀粉含量測定方法

實驗流程：煙草粉粹→過篩(40～100目)→除雜(飽和NaCl-乙醇溶液)→過濾(取濾渣)→提取(高氯酸溶液)→過濾(取濾液、淀粉提取液)→顯色反應(I2/KI溶液)→測吸光度。最后根據對應波長所測定的吸光度計算支鏈淀粉和直鏈淀粉的提取率。

配制直鏈淀粉標準液：稱取直鏈淀粉純品0.100 0g，置于100mL燒杯中，加入5mL1mol/LNaOH溶液，待溶解后轉移到容量瓶中，加蒸餾水定容至100mL，即為1mg/mL直鏈淀粉標準溶液。

配置支鏈淀粉標準液：用0.100 0g支鏈淀粉按上述方法制備成1mg/mL支鏈淀粉標準溶液。

取0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3和1.5mL(1mg/mL) 直鏈淀粉貯備溶液，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0和4.5mL(1mg/mL)支鏈淀粉貯備溶液，分別加入到50mL容量瓶中，加入蒸餾水30mL稀釋，將1.5mL高氯酸溶液(質量分數為45%)、氫氧化鈉溶液(2.5mol/L)調節pH值至3.5左右，加0.6mLKI(0.2gI2/2g)溶液，用蒸餾水定容至刻度，在室溫下顯色15min。以蒸餾水作空白，選定波長檢測其吸光度。

1.2.3煙葉組織結構觀察

采用日本JSM-6460LV掃描電鏡，將酶處理前后的處理煙葉平鋪于載樣臺上，按照常規方法噴金處理。噴金后樣品直接放入掃描顯微樣品室進行觀察。掃描中采用5.00kV的加速電壓。

2　結果與討論

2.1直鏈和支鏈淀粉的測定方法

用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計對直鏈淀粉和支鏈淀粉掃描，掃描光譜如圖1所示。根據雙波長法原理，選定波長具備2個特征：一是待測組分在選擇的測定波長上的吸光度差值較大；二是共存組分在測定波長應具有相同的吸收值，使其濃度變化不影響測定結果[13]。直鏈淀粉測定波長為510nm和590nm，支鏈淀粉測定波長為550nm和702nm。

圖1　支鏈淀粉和直鏈淀粉測定參比波長

直鏈淀粉標準曲線：根據雙波長原理在波長510nm和590nm測定吸光度值，以直鏈淀粉含量為橫坐標，ΔA=(A590nm-A510nm)為縱坐標，繪制標準曲線，如圖2所示。得直鏈淀粉回歸方程為：Y1=0.008 22X1+0.010 29，R2=0.996 9。在(5～30)mg/L線性良好。

支鏈淀粉標準曲線：在波長550nm和702nm測定吸光度值，以支鏈淀粉含量為橫坐標，ΔA=(A550nm-A702nm)為縱坐標，繪制標準曲線，如圖3所示。得到支鏈淀粉回歸方程為：Y2=0.002 65X2+0.008 19，R2=0.995。在40～90mg/L線性良好。

圖2　直鏈淀粉標準曲線

圖3　支鏈淀粉標準曲線

2.2酶處理前后淀粉含量分析

按照以上建立的標準曲線，采用雙波長法測定烤煙原樣以及酶處理之后煙葉中淀粉含量，檢測結果如表1所示。未經過任何處理的云煙85烤后煙葉中直鏈淀粉含量約為1.42%，支鏈淀粉約為2.67%。煙葉經過α-淀粉酶和糖化酶混合溶液，在55 ℃水浴鍋中浸泡降解8h后，直鏈淀粉和支鏈淀粉均有減少，其中直鏈淀粉減少了約34.5%，支鏈淀粉減少了約66.7%。這可能是因為支鏈淀粉在酶解過程中整個側鏈斷開而形成新的直鏈淀粉[14]，因此在整個酶解過程中支鏈淀粉的降解速度更快。采用雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901)對淀粉類酶處理煙葉的淀粉提取液與KI(0.2gI2/2g)溶液的顯色溶液進行光譜掃描，結果如圖4所示。由吸收光譜可以看出：相同質量煙葉酶處理前的吸收峰明顯高于酶處理之后的吸收峰，這表明α-淀粉酶和糖化酶對烤煙中的淀粉的降解有較好的效果。此外，酶處理后的最大吸收峰波長由處理前的591nm移向603nm，這主要因為云煙85酶處理前淀粉支鏈含量∶直鏈含量為1.88∶1，酶處理之后為1∶1.05，而直鏈淀粉的最大吸收峰為620nm，支鏈淀粉的最大吸收峰為560nm[15]，因此酶降解處理之后的淀粉提取液與KI(0.2gI2/2g)溶液顯色的最大吸收峰波長向高波長(直鏈淀粉最大吸收峰波長)移動。

表1　烤煙中酶處理前后淀粉含量

圖4　酶處理前后淀粉測定的吸收光譜圖

2.3煙葉組織結構變化情況分析

圖5分別為云煙85原樣、緩沖液處理樣品以及酶處理樣品的掃描電鏡圖。由圖5(a)、(b)可以看出：未經過緩沖液和酶液處理烤煙呈現出大量不規則、表面光滑的編織狀溝槽紋理結構[16]。圖5(c)、(d)為緩沖液浸泡處理8h后的煙葉組織電鏡圖，對比緩沖液處理前后，處理之后煙葉表面光滑凸起結構消失，變成扁平狀結構，裸露出少量纖維痕跡。這主要因為烤煙經過緩沖液浸泡以及清水的沖洗使組織中部分水溶性物質溶解流失，從而導致原有凸起結構發生變化形成扁平狀。圖5(e)、(f)為云煙85在α-淀粉酶15μg/g和糖化酶150μg/g混合液中浸泡處理8h后的煙葉組織掃描電鏡圖。酶液處理后的煙葉組織結構和原樣結構相比，表面光滑的編織狀溝槽紋理結構幾乎全部消失，與緩沖液浸泡處理烤煙結構相比扁平區域出現嚴重的凹凸不平現象，且呈現出更多的纖維線狀結構。這可能因為淀粉類酶的加入使煙葉中部分淀粉降解轉化成水溶性糖類溶解流失[17-18]，從而使原有的淀粉組織部位出現塌陷現象，形成大量雜亂凹凸不平區域。

3　結束語

本研究用α-淀粉酶和糖化酶處理云煙85烤后煙葉，對處理前后煙葉的淀粉含量以及煙葉的組織結構變化情況進行了研究。結果表明：α-淀粉酶和糖化酶處理云煙85，使直鏈淀粉減少約34.5%，支鏈淀粉減少約66.7%。淀粉類酶溶液對煙葉組織結構也有較大的影響；未經處理的煙葉組織呈現出大量不規則的、表面光滑的溝槽紋理結構，而經過淀粉類酶液處理之后的煙葉表面光滑的溝槽紋理結構幾乎全部消失，且在淀粉降解部位出現塌陷現象，有大面積凹凸不平區域。煙草中淀粉的減少與組織結構的變化對于煙草制品品質的提高應該具有較好的改善作用。

圖5　云煙85組織結構電鏡掃描圖

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(責任編輯劉舸)

收稿日期：2016-05-16

基金項目：重慶中煙工業有限責任公司科技項目“煙草中淀粉的存在形態及其分析方法研究”(hx201314)

作者簡介：羅丹(1989—)，女，重慶人，碩士研究生，主要從事材料化學研究。

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.07.011

中圖分類號：TS411.1

文獻標識碼：A

文章編號：1674-8425(2016)07-0064-05

EffectsofAmylasesonDegradationofStarchinFlue-CuredTobaccoLeaves

LUODan1，WUJun1，QUANXue-jun1，DAIYa2，MAKuo-yan2

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ChongqingUniveristyofTechnology,Chongqing400054,China；2.ChinaTobaccoChongqingIndustrialCo.,Ltd.,

Chongqing400062,China)

Abstract:The effects of amylases on the degradation of starch in flue-cured tobacco leaves were investigated using Yunyan 85 as the raw material in order to reduce the content of starch in flue-cured tobacco leaves. Results show that applying amylases to degrade starch in flue-cured tobaccos leaves was effective. Before treatment, the amylose and amylopectin contents in Yunyan 85 are 1.42% and 2.67% respectively. After 8 h treatment of flue-cured tobaccos leaves, the amylose and amylopectin contents in the sample leaves were decreased by about 34.5% and 66.7%, respectively. Scanning electron microscopy (SEM) observation showed that amylase treatment caused greater changes in the texture of the flue-cured tobacco leaves, and the original smooth surface was turned into rugged surface with obvious cellulose substance.

Key words：tobacco; starch; amylases；surface micro-structure

引用格式：羅丹，吳俊，全學軍，等.淀粉類酶降解烤煙中淀粉的研究[J].重慶理工大學學報(自然科學)，2016(7):64-68.

Citationformat：LUODan，WUJun，QUANXue-jun,etal.EffectsofAmylasesonDegradationofStarchinFlue-CuredTobaccoLeaves[J].JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience)，2016(7):64-68.