Akt-eNOS信號通路介導去甲腎上腺素調節內皮祖細胞動員*

姜其鈞，龔志剛，李志剛，丁世芳

(廣州軍區武漢總醫院心血管內科，武漢 430070)

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Akt-eNOS信號通路介導去甲腎上腺素調節內皮祖細胞動員*

姜其鈞，龔志剛，李志剛，丁世芳△

(廣州軍區武漢總醫院心血管內科，武漢 430070)

目的探討去甲腎上腺素(NE)對小鼠內皮祖細胞(EPCs)增殖能力、遷移能力及從骨髓動員的影響，并分析其分子機制。 方法取8周大C57小鼠隨機分為3組，各5只，分別為：空白對照組(皮下注射生理鹽水，無手術)，模型組(皮下注射生理鹽水，左下肢肢體缺血)，NE組(皮下注射NE 100 μmol/100 μL，左下肢肢體缺血)。采用小鼠左下肢股動脈結扎術制備肢體缺血模型，微滲泵持續泵入NE，流式細胞儀檢測小鼠骨髓、外周血和脾臟中EPCs；培養人外周血EPCs，用NE刺激，檢測EPCs的增殖和遷移能力，以及Akt-eNOS信號通路的激活情況。結果NE能夠促進肢體缺血小鼠骨髓EPCs的動員，增加外周血和脾臟的EPCs，NE組與模型組比較，骨髓[(3.271±0.772)%vs.(1.320±0.256)%]、外周血[(0.261±0.041)%vs.(0.110±0.028)%]和脾臟[(4.671±0.345)%vs.(1.880±0.0.381)%]EPCs均增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。NE能促進EPCs的增殖和遷移能力，且能夠呈濃度依賴性地激活EPCs內的Akt-eNOS信號通路。結論NE通過Akt-eNOS促進EPCs的遷移和增殖，以及在小鼠骨髓中的動員。

內皮祖細胞；去甲腎上腺素；增殖能力；遷移能力；動員

骨髓中有豐富的神經纖維分布，包括交感神經末梢[1]。在燙傷、外傷或肢體缺血的情況下，體內交感神經的活動程度會持續增強1～2周，并引起神經遞質的持續釋放[2]。研究表明，在上述情況下，骨髓中的內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)也被大量動員到血液中，參與各種損傷處血管的新生或內皮的修復[3]。而EPCs的釋放與骨髓中交感神經活動程度的關系目前仍不是特別清楚。交感神經參與人體對寒冷的適應，以及腫瘤發生等多個病理、生理過程[4]。骨髓中的交感神經纖維能夠向神經周圍分泌大量的神經遞質，如去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、多巴胺等。其中NE能夠刺激人體棕色脂肪細胞和腫瘤細胞釋放血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等細胞因子[5]，這些細胞因子在人體血管生成中發揮著關鍵作用。既往的研究還發現，這些神經遞質能夠參與調節許多血液細胞的生成，如單核細胞、紅細胞及髓細胞的生成，促進基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)等細胞因子的釋放，調節部分祖細胞的動員[6]。而本文的研究重點是探討交感神經的主要神經遞質NE是否能夠參與調節EPCs的動員，以及其分子機制。

1　材料與方法

1.1動物來源8周齡C57小鼠15只，均由湖北省疾病預防控制中心動物房提供。

1.2儀器與試劑Histopaque-1083分離液和Histopaque 1077淋巴細胞分離液均購自美國Amersham Biosciences公司；VEGF、成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)均購于英國Peprotech 公司；10%戊巴比妥、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、0.25%胰酶、NE均購自美國Sigma公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗小鼠CD34抗體、藻紅蛋白(PE)標記的抗小鼠Flk-1抗體和藻藍蛋白(APC)標記的抗小鼠CD45抗體均購自美國BD Biosciences公司；M199培養基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；鼠抗人磷酸化Akt IgG抗體、鼠抗人Akt IgG抗體、鼠抗人eNOS IgG抗體均購自美國Cell Signaling technology公司；鼠抗人磷酸化eNOS IgG抗體購自英國Abcam公司。24孔Transwell小室購自美國Millipore公司；MACSQuant流式分析儀購自德國Bergisch Gladbach公司；1002型號Alzet微量注射泵購自美國Alzet公司。

1.3方法

1.3.1分組和肢體缺血模型制備取8周大C57小鼠，隨機分為3組，各5只，分別為：空白對照組(皮下注射生理鹽水，無手術)，模型組(皮下注射生理鹽水，左下肢肢體缺血)，NE注射手術組(NE組，皮下注射NE 100 μmol/100 μL，左下肢肢體缺血)，根據分組分別采取手術和藥物干預。肢體缺血模型小鼠均采用腹腔注射10%戊巴比妥麻醉，切開左下肢前側皮膚，顯微鏡下分離和結扎左下股動脈的近側和遠側，剪斷股動脈及其分支，消毒后縫合皮膚，于小鼠背側皮下植入裝有藥物的Alzet微量注射泵(含NE 100 μmol/100 μL或生理鹽水)，繼續于無特殊病原體(SPF)的環境飼養1周。

1.3.2外周血、骨髓和脾臟EPCs的流式分析將手術干預后的小鼠飼養1周后處死，采集外周血、脾臟和骨髓組織，使用Histopaque-1083分離液分離小鼠外周血、脾臟組織勻漿和骨髓細胞沖洗液中的單個核細胞，加入FITC標記的抗小鼠CD34抗體，PE標記的抗小鼠Flk-1抗體和APC標記的抗小鼠CD45抗體，冰上孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，4%甲醛固定，MACSQuant流式分析儀計數樣品中CD45-/CD34+/Flk-1+細胞數量。

1.3.3人EPCs的分離與培養采集健康志愿者的外周血，按1∶2的比例加入PBS稀釋，用移液器緩慢地將標本移至Histopaque 1077淋巴細胞分離液上方，400×g離心30 min，取中間層單核細胞，PBS清洗2遍，加入含10%FBS、10 ng/mL VEGF、10 ng/mL bFGF的M199培養液，將標本稀釋成5×106/mL，放入恒溫孵箱(37 ℃、5% CO2)中培養，4 d后洗掉未貼壁細胞，每3天換1次培養液，于第7天再進行后續試驗。

1.3.4人EPCs增殖能力評價采用MTT比色評價人EPCs的增殖能力。將人EPCs以每孔1×103個細胞的密度種于96孔板，加入NE或其他藥物干預72 h，加入MTT 37 ℃孵育4 h，酶標儀檢測反應細胞數量450 nm波長處的吸光度值(A450值)。

1.3.5人EPCs遷移能力檢測采用Transwell小室評價人EPCs的遷移能力。將人EPCs以每孔2×104個細胞的密度種植于24孔板Transwell小室的上室，下室加入含50 μg/L VEGF的培養液，以未加入藥物干預的細胞為對照組，1 h后將不同濃度NE加于上室，恒溫孵箱(37 ℃、5% CO2)孵育24 h，4%多聚甲醛固定細胞，棉簽擦去隔膜上側的細胞，浸入結晶紫染色3 min，清水洗去結晶紫，在高倍光學顯微鏡(×100)下計數隔膜下側6個隨機視野的人EPCs數量。

1.3.6蛋白質印跡法(Western blotting)檢測在藥物干預后的人EPCs中加入蛋白提取裂解液，于4 ℃裂解細胞30 min，低溫離心機(4 ℃ 8 000×g)離心30 min，去除沉淀，加入上樣緩沖液，煮沸10 min，于12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉入硝酸纖維素膜，5%無脂牛奶封閉1 h，分別加入鼠抗人磷酸化eNOS IgG抗體、鼠抗人eNOS IgG抗體、鼠抗人磷酸化Akt IgG抗體和鼠抗人Akt IgG抗體，4 ℃孵育12 h，用含吐溫-20的Tris緩沖生理鹽水(TBST)洗3次，羊抗鼠二抗室溫下孵育1 h，電化學發光液(ECM)顯影，采用Image-pro plus6.0軟件分析信號強度。

2　結　果

2.1各組小鼠骨髓、外周血及脾臟EPCs含量比較采用流式細胞儀檢測外周血、骨髓和脾臟中EPCs的表達，結果顯示：模型組與空白對照組比較，外周血[(0.110±0.028)%vs.(0.040±0.009)%]、骨髓[(1.320±0.256)%vs. (0.550±0.172)%]和脾臟[(1.880±0.038 1)%vs. (0.610±0.256%)]EPCs的數量均上升，差異均有統計學意義(P<0.01)；NE組與模型組比較，外周血[(0.261±0.041)%vs. (0.110±0.028)%]、骨髓[(3.271±0.772)%vs. (1.320±0.256%)]和脾臟[(4.671±0.345%vs. (1.880±0.038 1%)]EPCs的數量也均上升，差異均有統計學意義(P<0.01)，表明NE進一步促進EPCs動員。見圖1。

*：P<0.01，與空白對照組比較；#：P<0.01，與模型組比較。

圖1骨髓、外周血和脾臟的EPCs流式細胞圖像及各組EPCs含量比較

2.2NE刺激EPCs的增殖和遷移于培養至第8天的人EPCs培養液中加入NE，使其濃度為10 μmol/L，3 d后MTT法檢測細胞數量，結果顯示：NE組人EPCs細胞增殖率為對照組的(307.1±97.7)%，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2A。取培養至第8天的人EPCs進行遷移試驗，在上室中加入NE，使其濃度為1 μmol/L，24 h后取出Transwell小室，鏡下計數隔膜下每個高倍視野(×100)的EPCs數量，結果顯示：NE組與對照組比較，每高倍視野EPCs計數明顯增加[(124±12)vs.(57±14)]，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2B。結晶紫染色遷移入下室的EPCs圖像見圖3。

A：增殖能力；B：遷移能力；*：P<0.01，與空白對照組比較。

圖2對照組與NE組人EPCs的增殖與遷移能力比較

A：對照組；B：NE組。

圖3遷移入下室的EPCs圖像(結晶紫染色×100)

*：P<0.01，與對照組比較。

圖4不同濃度NE激活Akt比較

*：P<0.01，與對照組比較。

圖5不同濃度NE激活eNOS比較

2.3Akt-eNOS信號通路的激活Western blotting檢測結果顯示：NE能夠劑量依賴性地激活Akt-eNOS信號通路。在人EPCs的培養液中分別加入濃度0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的NE，結果顯示：以上各NE濃度下EPCs的磷酸化Akt相對于對照組分別為(385.7±58.5)%、(756.6±123.9)%、(638.2±271.9)%和(493.3±41.4)%，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖4。磷酸化eNOS相對于對照組分別為(97.0±14.7)%、(119.7±11.8)%、(199.0±49.7)%和(131.3±30.2)%，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

3　討　論

本研究結果顯示，NE能夠顯著地刺激EPCs的增殖、遷移能力，促進肢體缺血小鼠骨髓中EPCs的動員，增加外周血EPCs水平及EPCs在脾臟的沉積，且NE主要通過Akt-eNOS信號通路介導這種作用。

EPCs現已經被用于創傷修復、缺血性疾病的治療和組織工程學領域[7]。有研究報道，接受人EPCs治療的小鼠下肢血流量明顯增加，缺血肢體成活率明顯提高[8]。用動物缺血模型行自體骨髓EPCs體外擴增回輸，發現缺血部位再灌注和側支循環增加。EPCs對缺血性心血管疾病有明顯的治療作用，以骨髓擴增EPCs對心肌梗死患者做冠狀動脈內注射，對比發現骨髓EPCs治療后心功能明顯改善[9]。

在生理條件下，外周循環中EPCs含量非常少，僅占全部單核細胞的0.03%～0.06%。骨髓是EPCs的主要來源地，在各種血管損傷、缺血、燒傷、創傷或者細胞因子刺激的作用下，EPCs可從骨髓中動員進入血液循環系統，遷移到損傷內皮處，修復損傷血管，或者新生出滋養血管。EPCs的動員及功能受到如高血壓、吸煙、高血脂和高血糖等多種因素影響[10]。既往認為，局部缺血是介導EPCs動員的主要信號。而現在的研究發現，除此之外，許多生理激素如雌激素、促紅細胞生成素等也參與調節EPCs的動員及其功能。最近的研究發現，骨髓中的自主神經末梢在骨髓各種細胞功能的調節中發揮著非常重要的作用。如D2受體被多巴胺激活后能起到抑制EPCs動員的作用[11]。既往研究還發現，NE能夠顯著增加體外培養的骨髓造血細胞的增殖率和細胞內RNA的合成[12]。而本研究發現，組織中生理濃度的NE(0.023～7.3 μmol/L)能夠明顯刺激EPCs的增殖和遷移能力。

NE在體內的分泌呈周期性變化，是人體晝夜節律調節最重要的物質之一[13]。而最近的研究發現，EPCs在體內分泌的周期性和高峰與交感神經活動的周期和高峰嚴格吻合[14]。這說明NE調節EPCs的動員可能是人體規律性的全身修復活動的一部分。并且，在缺血、燒傷、創傷等許多疾病情況下，交感神經同樣被顯著地激活。與此同時，EPCs的動員也明顯增加。因此，無論在生理還是病理狀態下，NE均是EPCs動員的重要調節因子。這可能也是創傷和缺血性疾病時，EPCs可迅速動員的機制之一。

EPCs內有多條活躍的信號傳遞通道。既往研究發現，NE能夠通過激活Akt信號分子和eNOS信號分子，促進一氧化氮(NO)的產生，進一步激活造血細胞的增殖和遷移能力[15]。本研究發現，NE主要通過Akt-eNOS信號分子刺激人EPCs的增殖和遷移能力，并進一步促進肢體缺血小鼠EPCs的動員。許多在棕色脂肪細胞和內皮細胞中的研究發現，NE主要通過α1和β3腎上腺受體激活細胞內的Akt-eNOS信號通路。而NE是通過何種受體激活EPCs，還需要進一步的研究確定。

綜上所述，本研究結果提示：NE能夠通過Akt-eNOS信號通路調節EPCs的增殖和遷移能力，以及EPCs在骨髓中的動員，增加外周血EPCs的數量和在靶器官的沉積，為進一步揭示神經系統調節血管修復細胞的功能提供了理論依據。

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Akt-eNOS signal pathway for mediating norepinephrine regulating mobilization of endothelial progenitor cells*

JiangQijun,GongZhigang，LiZhigang，DingShifang

(DepartmentofCardiology,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryRegion,Wuhan,Hubei430070,China)

ObjectiveTo investigate the effect of norepinephrine (NE) on the proliferation and migration capacity of endothelial progenitor cells (EPCs),and bone marrow mobilization and to analyze its molecular mechanism.MethodsThe 8-week old C57 mice were taken and randomly divided into 3 groups,5 cases in each group:the blank control group(subcutaneous injection of normal saline without operaion),model group(subcutaneous injection of normal saline and ischemia in left lower extremity) and NE group(subcutaneous injection of NE 100 μmol/100 μL and ischemia in left lower extremity).The limb ischemia model was prepared by adopting the femoral arterial ligation in mouse left lower extremity,then NE was continuously pumped by the micro-osmotic pump.The EPCs contents from bone marrow,peripheral blood and spleen were assayed with the flow cytometric analyzer;human peripheral blood EPCs were cultured and stimulated by NE.The proliferation and migration capacity,and the activation situation of Akt and eNOS signal pathway were detected.ResultsNE could promote the mobilization of bone marrow EPCs in limb ischemia mice,increased the EPCs quantity of peripheral blood and spleen,comparing the NE group with the model group,the EPCs quantity was increased for bone marrow[(3.271±0.772)%vs.(1.320±0.256)%],peripheral circulation[(0.261±0.041)%vs.(0.110±0.028)%] and spleen[(4.671±0.345)%vs.(1.880±0.0.381)%],the differences were statistically significant(P<0.01).NE could promote the proliferation and migration capacity,moreover could activate the Akt-eNOS signal pathway in EPCs with a dose dependent manner.ConclusionNE could promote the proliferation and migration of EPCs and mouse bone marrow mobilization via the Akt-eNOS signal pathway.

endothelial progenitor cells；norepinephrine；proliferation capacity；migration capacity；mobilization

論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.004

湖北省自然科學基金面上資助項目(2014CFC1055)；湖北省自然科學基金重點資助項目(2014CAF066)。作者簡介：姜其鈞(1982-)，主治醫師，博士，主要從事冠心病的診治研究。△

，E-mail:DingSFMD@gmail.com。

R329

A

1671-8348(2016)19-2602-04

2015-12-28

2016-02-26)