光感基因調(diào)控技術(shù)對(duì)脊髓損傷后膀胱的病理改變及其逼尿肌受體的影響

呼和，張志成，蔣飛，劉佳

(1.大連市兒童醫(yī)院外二科，遼寧 大連　116021；2.北京軍區(qū)總醫(yī)院骨科，北京　100700)

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實(shí)驗(yàn)研究

光感基因調(diào)控技術(shù)對(duì)脊髓損傷后膀胱的病理改變及其逼尿肌受體的影響

呼和1，張志成2，蔣飛1，劉佳2

(1.大連市兒童醫(yī)院外二科，遼寧 大連116021；2.北京軍區(qū)總醫(yī)院骨科，北京100700)

摘要：目的觀察光感基因調(diào)控技術(shù)對(duì)骶上脊髓損傷所致神經(jīng)源性膀胱功能的影響。方法50只大鼠經(jīng)尿流動(dòng)力學(xué)檢查無(wú)異常后進(jìn)行隨機(jī)分組，并采用T10脊髓完全橫斷建立脊髓損傷動(dòng)物模型，分為假手術(shù)對(duì)照組、脊髓損傷無(wú)藍(lán)光刺激組和脊髓損傷藍(lán)光刺激組，利用HE染色技術(shù)對(duì)骶髓行藍(lán)光照射前后膀胱的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察，并且通過Real timePCR技術(shù)檢測(cè)毒蕈堿型乙酰膽堿受體(muscarinic acetylcholine receptor) M2、M3和β3腎上腺素能受體(β3-adrenergic receptor，β3-AR)在大鼠膀胱逼尿肌中的表達(dá)。結(jié)果與脊髓損傷無(wú)藍(lán)光刺激組相比，在HE染色結(jié)果中脊髓損傷藍(lán)光刺激組逼尿肌細(xì)胞形態(tài)大小相對(duì)均一，肌纖維排列較有序，趨近于假手術(shù)組。Real timePCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，M2-AR mRNA和M3-AR mRNA的表達(dá)在脊髓損傷無(wú)藍(lán)光刺激組顯著升高(P<0.05)；而經(jīng)藍(lán)光照射一定時(shí)間后，上述兩種受體mRNA的表達(dá)降低(P<0.05)，β3-AR mRNA的表達(dá)與M-AR表達(dá)相反。結(jié)論光感基因技術(shù)可以通過調(diào)控逼尿肌受體修復(fù)骶上脊髓完全性損傷后神經(jīng)源性膀胱。

關(guān)鍵詞：脊髓損傷；神經(jīng)源性膀胱；光感基因；乙酰膽堿受體；β腎上腺素能受體

近年來(lái)，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)引起的神經(jīng)源性膀胱(neurogenic bladder，NB)已經(jīng)日益引起廣泛的關(guān)注。

目前，對(duì)骶上脊髓損傷所致的痙攣性膀胱的治療雖然已經(jīng)取得一定程度的進(jìn)展，但仍然存在許多缺陷。早在1979年，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Crick博士曾預(yù)測(cè)說“光很有可能成為特異性調(diào)控某一類神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)的工具”。Channelrhodop sin-2(ChR2)是從單細(xì)胞綠色藻類Chlamydomonas reinhardtii中分離出來(lái)的一種感光性蛋白質(zhì)[1]。ChR2的光活化光譜在350～550 nm范圍內(nèi)(中心波長(zhǎng)為470 nm)。表達(dá)ChR2的細(xì)胞在此波段的光照下，ChR2通道打開，Na+、K+、Ca2+等進(jìn)入胞內(nèi)，產(chǎn)生內(nèi)向電流，造成細(xì)胞去極化產(chǎn)生動(dòng)作電位引發(fā)細(xì)胞興奮[2]。這樣，利用不同波長(zhǎng)的光可實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物活體水平上對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行精確的干預(yù)和調(diào)控[3]。根據(jù)ChR2在神經(jīng)回路的研究，已經(jīng)逐漸將其應(yīng)用于臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病的探索。

本實(shí)驗(yàn)采用T10脊髓完全橫斷建立脊髓損傷動(dòng)物模型，擬構(gòu)建ChR2光感基因載體，精確注射于骶上完全性橫斷性胸脊髓損傷大鼠骶髓雙側(cè)副交感神經(jīng)核(Sacral Parasympathetic Nucleus，SPN)內(nèi)[4-5]，使其表達(dá)ChR2通道蛋白，骶髓行藍(lán)光照射，光感基因活化技術(shù)刺激支配膀胱逼尿肌的SPN產(chǎn)生興奮，利用HE染色技術(shù)對(duì)骶髓行藍(lán)光照射前后膀胱的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察，并且通過Real time PCR技術(shù)檢測(cè)毒蕈堿型乙酰膽堿受體(muscarinic acetylcholine receptor)M2、M3在大鼠膀胱逼尿肌中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步證實(shí)光感基因修復(fù)骶上脊髓完全性損傷后神經(jīng)源性膀胱的可能性提供分子水平的理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組正常成年Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠50只，經(jīng)尿流動(dòng)力學(xué)檢查無(wú)異常后進(jìn)行隨機(jī)分組，分為假手術(shù)對(duì)照組(A組，10只，僅作背部皮膚肌肉切開和縫合)和脊髓損傷組(B組，40只，暴露脊髓胸腰段，行脊髓完全橫斷)，采用T10脊髓完全橫斷建立脊髓損傷動(dòng)物模型。術(shù)后2周進(jìn)行尿動(dòng)力檢查，以出現(xiàn)逼尿肌亢進(jìn)及逼尿肌一括約肌協(xié)同失調(diào)作為神經(jīng)源性膀胱診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)是否植入光感基因行藍(lán)光照射將B組分為C組(損傷無(wú)藍(lán)光刺激組)與D組(損傷藍(lán)光刺激組)。

1.1.2主要試劑和儀器10%水合氯醛溶液(北京軍區(qū)總醫(yī)院制劑中心)；0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司)；注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠)；PBS粉劑(北京化學(xué)試劑公司)；甲醛溶液(濟(jì)南魯康化學(xué)工業(yè)有限公司)；MP-150生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(美國(guó)泰德科技有限公司)；顯微手術(shù)器械(南昌新長(zhǎng)征醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1建立脊髓損傷動(dòng)物模型麻醉后，以T10椎體棘突為中心沿背側(cè)正中線做長(zhǎng)約3.5 cm的縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜，并向兩邊鈍性剝離豎棘肌至橫突外側(cè)，用撐開器撐開并顯露相鄰上下胸椎的棘突和椎板，用自制微型咬骨鉗向上逐漸依次咬除整個(gè)T10椎板及兩側(cè)關(guān)節(jié)突，在咬除過程中避免損傷脊髓的硬脊膜、血管及神經(jīng)根。將顯露的脊髓做橫向切斷，此時(shí)大鼠出現(xiàn)雙下肢抽搐、尾巴甩動(dòng)、隨即停止的現(xiàn)象，證實(shí)脊髓完全橫斷。

1.2.2HE染色固定組織制作石蠟切片，石蠟切片脫蠟置水；二甲苯I、Ⅱ分別脫蠟8 min，自來(lái)水沖洗；無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ，75%、80%乙醇分別浸泡3 min；PBS浸泡3 min；置于蘇木素溶液中5～10 min，充分水洗；浸飽和碳酸鋰還原；置于伊紅液中1 min；80%、95%乙醇，無(wú)水乙醇I、Ⅱ分別浸泡3 min；PBS浸泡3 min；二甲苯透明、溫封。

1.2.3Real-time RT-PCR檢測(cè)a)引物設(shè)計(jì)；b)總RNA提?。籧)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及其反應(yīng)條件；d)Real-time PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

擴(kuò)增條件：變性95℃ 3 min，延伸72℃ 45 s；退火溫度是95℃，12 s，40個(gè)循環(huán)。β-actin的退火溫度是62℃，40 s，27個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行內(nèi)加goldview TM核酸染料的2%的瓊脂糖凝膠電泳，Quantityone拍照并分析。

表1　逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及其反應(yīng)條件

表2　Real-time PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

1.2.4藍(lán)光刺激的方法選擇致傷后大鼠，切除L1～2椎板，顯露腰骶段硬膜囊，顯微鏡下切開硬膜囊，根據(jù)定位坐標(biāo)值為脊髓正中兩側(cè)0.2 mm，深度0.5 mm，在雙側(cè)SPN內(nèi)注射攜帶ChR2基因的腺病毒載體(已由中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所構(gòu)建完成)，分為上下各三點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.1 μL，病毒量為1.0×108單位，注射后留針10 min。選擇波長(zhǎng)470 nm的藍(lán)光，LED發(fā)光二極管(5 mm×3.5 mm)縫合于切口。二極管電源可使用電腦程序控制，從而控制發(fā)光的頻率和節(jié)律(每分鐘照射1 s，持續(xù)15 min，每日重復(fù)3次，照射至脊髓傷后2周)。

2　結(jié)　　果

2.1膀胱組織HE染色結(jié)果與假手術(shù)組相比，脊髓損傷無(wú)藍(lán)光刺激組在光鏡下觀察可見黏膜下層有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，逼尿肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，肌細(xì)胞胞漿內(nèi)肌纖維空泡樣變明顯；脊髓損傷藍(lán)光刺激組逼尿肌細(xì)胞形態(tài)與大小相對(duì)均一，肌纖維排列較有序，趨近于假手術(shù)組(見圖1～3)。

圖1　假手術(shù)組膀胱逼尿肌的HE染色(HE，×100)

圖2　脊髓損傷無(wú)藍(lán)光刺激組膀胱逼尿肌的HE染色(HE，×100)

圖3　脊髓損傷藍(lán)光刺激組膀胱逼尿肌的HE染色(HE，×100)

2.2乙酰膽堿受體M2-AR、M3-AR和腎上腺素受體β3-AR的Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，M2-AR mRNA和M3-AR mRNA的表達(dá)與假手術(shù)組相比，脊髓損傷無(wú)藍(lán)光刺激組顯著升高(P<0.05)；而經(jīng)藍(lán)光照射一定時(shí)間后，兩種受體mRNA的表達(dá)降低(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖4)。

Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，損傷無(wú)藍(lán)光刺激組β3-AR mRNA的表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著降低，P<0.05；而損傷藍(lán)光刺激組與損傷無(wú)藍(lán)光刺激組相比，β3-AR mRNA的表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

3　討　　論

注：a-損傷無(wú)藍(lán)光刺激組與假手術(shù)組比較，P<0.05；b-損傷藍(lán)光刺激組與損傷無(wú)藍(lán)光刺激組比較，P<0.05；c-損傷藍(lán)光刺激組與假手術(shù)組比較，P>0.05

圖4M2-AChR mRNA和M3-AChR mRNA在各組中的表達(dá)情況比較

脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱功能障礙是臨床嚴(yán)重的傷殘之一。據(jù)國(guó)內(nèi)外長(zhǎng)期隨訪研究證實(shí)，SCI患者晚期死亡的主要原因是泌尿系感染和腎功能衰竭(43%～75%)[6]。故尋找有效治療SCI并發(fā)癥的方法成為目前亟待解決的臨床問題。

支配膀胱逼尿肌的神經(jīng)主要為膽堿能神經(jīng)[7]，該神經(jīng)通過副交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放的乙酰膽堿作用于膀胱逼尿肌內(nèi)M受體發(fā)揮作用。M受體在逼尿肌中含量最高，尤以膀胱體部含量最高，其含有多種亞型，主要為M2和M3受體[2]。乙酰膽堿通過M3受體直接介導(dǎo)膀胱逼尿肌的收縮，而M2受體不能直接作用于逼尿肌，需要通過抑制乙酰環(huán)化酶，進(jìn)而抑制β受體調(diào)節(jié)的松弛作用而達(dá)到間接介導(dǎo)逼尿肌收縮。采用Real-time PCR測(cè)定膀胱逼尿肌細(xì)胞M2、M3受體mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)脊髓橫斷損傷后可以引起M2、M3受體mRNA的表達(dá)增加，使逼尿肌對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)及其類似物更加敏感，興奮性增加，出現(xiàn)逼尿肌收縮亢進(jìn)反應(yīng)，即神經(jīng)源性膀胱。對(duì)脊髓損傷后的老鼠給予一段時(shí)間的藍(lán)光刺激，發(fā)現(xiàn)M2、M3受體mRNA的表達(dá)降低，表明藍(lán)光照射副交感神經(jīng)核內(nèi)的光感基因可以通過減少M(fèi)2、M3受體mRNA的表達(dá)進(jìn)而使逼尿肌細(xì)胞的Ca2+和CaM濃度降低，降低逼尿肌的收縮力和逼尿肌興奮性，減少逼尿肌異常收縮頻率。

注：a-損傷無(wú)藍(lán)光刺激組與假手術(shù)組比較，P<0.05；b-損傷藍(lán)光刺激組與損傷無(wú)藍(lán)光刺激組比較，P<0.05；c-損傷有藍(lán)光刺激組與假手術(shù)組比較，P>0.05

圖5β3-AR mRNA在各組中的表達(dá)情況比較

β腎上腺素能受體，主要分布于膀胱體部平滑肌，受交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放的神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素影響，從而控制膀胱的舒張。β3-AR分為三種亞型，其中β3直接介導(dǎo)逼尿肌的松弛[8]。Real-time PCR測(cè)定β3-AR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，損傷無(wú)藍(lán)光刺激組β3-AR mRNA的表達(dá)顯著降低，損傷藍(lán)光刺激組β3-AR mRNA與損傷無(wú)藍(lán)光刺激組相比，表達(dá)顯著升高。這表明藍(lán)光照射可以影響逼尿肌細(xì)胞β3-AR介導(dǎo)的Cyclic Adenosine monophosphate-Protein Kinase A(cAMP-PKA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，提高膀胱儲(chǔ)存尿液的能力。

HE染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)過一定時(shí)間的藍(lán)光照射后脊髓損傷的膀胱在光鏡下黏膜下層炎細(xì)胞減少，逼尿肌細(xì)胞縮小，排列有序，肌細(xì)胞包漿內(nèi)肌纖維空泡樣消失，表明在藍(lán)光的刺激下膀胱功能得到一定程度的恢復(fù)。

該研究從病理改變和分子水平證實(shí)了光感基因調(diào)控技術(shù)可以改善脊髓損傷后膀胱功能障礙，為進(jìn)一步的相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)。但是關(guān)于光感基因如何調(diào)控逼尿肌受體的分子機(jī)制尚不十分清楚，有待于進(jìn)一步討論。

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文章編號(hào)：1008-5572(2016)07-0612-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81200960)

中圖分類號(hào)：R683.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

收稿日期：2015-10-10

作者簡(jiǎn)介：呼和(1982- )，男，主治醫(yī)師，大連市兒童醫(yī)院外二科，116021。

Effect of Light Gene Regulation on Pathology Changes and Detrusor Receptors of Bladder after Spinal Cord Injury

Hu He1，Zhang Zhicheng2，Jiang Fei1，et al

(1.The Second Surgery Department，Dalian Children′s Hospital，Dalian116021，China；2.Orthopaedic Department，General Hospital of Beijing PLA District，Beijing100700，China)

Abstract：ObjectiveTo observe of the effect of light gene regulation on neurogenic bladder function recovery by the upper-sacral spinal cord injury in rats.Methods50 rats which had no abnormalities after urine flow dynamic test were randomized and the 10 thoracic spinal cord complete transection animal model was set up，dividing into the control group，no blue light stimulation of spinal cord injury group and blue light stimulation of spinal cord injury group.The bladder morphological changes before and after the use of blue light stimulation were observed by HE staining technique.Furthermore，the express of M-AR and β-AR were tested by Real timePCR in the rat bladder detrusor.ResultsCompared with no blue light stimulation of spinal cord injury group，detrusor cells were relatively uniform shape and size while the more muscle fibers arranged in an orderly，closing to control group.Real timePCR technical results show that，compared with the control group，the expression of M2-AR mRNA and M3-AR mRNA in no blue light stimulation of spinal cord injury group was significantly higher (P<0.05) while the express was lower in the blue light stimulation of spinal cord injury group(P<0.05).β3-AR mRNA expression and M-AR expression were contrary.ConclusionLight gene regulation can repair the neurogenic bladder dysfunction of upper-sacral spinal cord injury by regulating the detrusor receptors.

Key words：spinal cord injure；neurogenic bladder；light gene；acetylcholine receptors；β-adrenergic receptor