VEGF和SLeX表達與甲狀腺乳頭狀癌浸潤轉移的關系

李永慶尚培中柳勇張星光張進權南潤玲谷化平

VEGF和SLeX表達與甲狀腺乳頭狀癌浸潤轉移的關系

李永慶①尚培中①柳勇①張星光②張進權③南潤玲①谷化平①

目的：探討VEGF和SLeX在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其與癌組織浸潤轉移的關系。方法：應用免疫組化染色EliVisionTMplus兩步法檢測164例甲狀腺乳頭狀癌組織和30例癌旁甲狀腺組織中VEGF 和SLeX的表達狀況。結果：癌組織中VEGF和SLeX總體陽性表達率分別為59.8%（98/164）和70.7% （116/164），癌旁甲狀腺組織中VEGF和SLeX總體陽性表達率分別為13.3%（4/30）和6.7%（2/30），兩者在癌組織總體陽性表達率顯著高于癌旁組織（P＜0.05）；有浸潤患者VEGF和SLeX總體陽性表達率分別為69.7%（69/99）和84.8%（84/99），無浸潤患者分別為44.6%（29/65）和49.2%（32/65），兩者在有浸潤患者中的總體陽性表達率均顯著高于無浸潤患者（P＜0.05）；有淋巴結轉移患者VEGF和SLeX總體陽性表達率分別為69.9%（65/93）和89.2%（83/93），無淋巴結轉移患者均為46.5%（33/71），兩者在有淋巴結轉移患者中的總體陽性表達率均顯著高于無淋巴結轉移患者（P＜0.05）。癌組織VEGF與SLeX表達呈正相關（r=0.59）。結論：VEGF和SLeX在甲狀腺乳頭狀癌組織中多數呈強陽性表達，兩者與癌組織浸潤轉移密切相關。

甲狀腺腫瘤； VEGF； SLeX； 浸潤； 轉移

First-author’s address：The 251st Hospital of Chinese PLA，Zhangjiakou 075000，China

研究發現，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在腫瘤中高表達可刺激新生血管形成，維持其持續生長，促進腫瘤轉移。唾液酸化Lewis X（sialyl Lewis X，SLeX）屬Lewis血型決定簇Ⅱ型抗原，通過與配體分子選擇素結合，可介導與內皮細胞的黏附作用，促進癌細胞轉移播散。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的一種病理類型，幾乎所有的兒童甲狀腺癌和60%～80%的成人甲狀腺癌均為PTC［1-3］。本文采用免疫組化染色EliVisionTMplus兩步法檢測164例PTC組織VEGF 和SLeX的表達，探討它們與PTC浸潤與轉移的關系，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2009年3月-2016年2月在本院行手術治療的PTC患者164例，其中男53例，女111例；年齡17～75歲，平均（39.4±11.9）歲。所有患者術前均未曾接受任何相關治療，行彩超、CT、磁共振等影像學檢查了解腫瘤大體情況；術中根據具體探查以及納米炭混懸液淋巴示蹤，按照治療指南及專家共識確定甲狀腺切除和頸淋巴結清除范圍；術后根據病理診斷及免疫組化結果，綜合判定腫瘤大小、部位，是否有甲狀腺包膜、腺體外組織或血管浸潤，以及區域淋巴結轉移狀況。本組有浸潤者99例，無浸潤者65例。有淋巴結轉移者93例，無轉移者71例。癌旁組織作為對照組30例，選自距瘤體2 cm的同側或對側甲狀腺。

1.2納入標準 入選患者原發癌瘤直徑＞1.0 cm，術前針吸細胞學診斷或術中冰凍快速病理診斷為PTC，術中證實未累及氣管、食管。所有患者及家屬均知情同意并簽字，研究方案通過醫院倫理委員會批準。

1.3排除標準 （1）直徑≤1.0 cm的微小乳頭狀癌；（2）術前曾接受甲狀腺制劑、131I或中藥治療的患者；（3）合并甲狀腺炎；（4）伴發其他部位腫瘤；（5）伴發其他部位明顯炎性疾病。

1.4手術治療方法 直徑＞1.0 cm的單側單灶PTC，施行患側腺葉全切除+峽部切除術、患側腺葉全切除+峽部切除+對側腺葉次全/部分切除術，以及全甲狀腺切除術；單側多灶PTC、雙側PTC、有明顯腺體外浸潤或頸淋巴結轉移者，施行近全甲狀腺切除或全甲狀腺切除術。對低危、中危患者施行選擇性頸淋巴結清除術（selective neck dissection，SND），對高危患者施行功能性頸淋巴結清除術（functional neck dissection，FND）或簡化的FND。

1.5免疫組化染色方法 即用型鼠抗人VEGF和SLeX單克隆抗體、EliVision試劑盒和均購自福州邁新生物技術開發有限公司。所有手術標本均經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，常規制備4 μm厚連續切片，65 ℃烘烤備用［4］。采用EliVisionTMplus二步法，具體操作步驟：（1）石蠟切片脫蠟和水化后，用微波（micro-wave，MW）5檔（輸出功率90 W，下同），磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1 min×3；（2）微波-枸櫞酸鈉緩沖液（0.01 mol/L，pH值6.0）進行抗原修復，先用MW3檔（輸出功率150 W）修復抗原2 min，再用MW5檔修復抗原2×5 min，待自然冷卻至近室溫時自來水洗，PBS洗1 min×3；（3）用MW5檔，在甲醇-雙氧水中封閉內源性過氧化物酶2 min，PBS洗1 min×3；（4）加一抗，4 ℃冰箱過夜，從冰箱中取出后，MW5檔5 min，PBS洗2 min×3；（5）加聚合物增強劑，室溫下孵育20 min，PBS洗2 min×3；（6）加生物素化的鼠抗人IgG（1∶300），37 ℃、30 min，然后再MW5檔5 min，PBS洗2 min×3；（7）3，3’-二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB-H2O2）顯色10 min；自來水終止顯色；（8）蘇木素復染0.5～1.0 min；（9）切片常規酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化染色后由兩位有經驗的病理醫師在光學顯微鏡下進行雙盲獨立觀察，確定染色結果。由福州邁新生物技術開發有限公司提供的陽性染色切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.6判定標準 陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色。（1）按染色深淺強度評分：無染色0分，棕黃色1分，棕褐色2分；（2）按染色癌細胞所占比例記分：≤30% 1分，31%～70% 2分，≥71% 3分。每例積分為兩項記分之和，按高低分3級：陰性（-）0分，弱陽性（+）1～3分，強陽性（++）4～6分。弱陽性和強陽性均計為陽性。

1.7統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1VEGF和SLeX在癌組織及癌旁組織中的表達 陽性物質定位于細胞質和細胞膜。癌組織中VEGF和SLeX總體陽性表達率分別為59.8% （98/164）和70.7%（116/164），其中強陽性表達率分別為33.5%（55/164）和38.4%（63/164），弱陽性表達率分別為26.2%（43/164）和32.3%（53/164），陰性表達率分別為40.2%（66/164）和29.3% （48/164）；癌旁甲狀腺組織中VEGF和SLeX總體陽性表達率分別為13.3%（4/30）和6.7%（2/30），其中強陽性表達率分別為3.3%（1/30）和0，弱陽性表達率分別為10.0%（3/30）和6.7%（2/30），陰性表達率分別為86.7%（26/30）和93.3%（28/30）。癌組織與癌旁甲狀腺組織比較，VEGF總體陽性表達率、強陽性表達率比較差異均有統計學意義（字2=21.920、11.267，P＜0.05），而弱陽性表達率之間差異無統計學意義（字2=3.688，P＞0.05）。SLeX總體陽性表達率、強陽性表達率和弱陽性表達率比較差異均有統計學意義（字2=43.683、17.067、8.214，P＜0.05），見表1。

2.2VEGF和SLeX表達與浸潤轉移的關系 有浸潤患者VEGF和SLeX總體陽性表達率分別為69.7%（69/99）和84.8%（84/99），其中強陽性表達率分別為38.4%（38/99）和49.5%（49/99），弱陽性表達率分別為31.3%（31/99）和35.4% （35/99），陰性表達率分別為30.3%（30/99）和15.2%（15/99）；無浸潤患者VEGF和SLeX總體陽性表達率分別為44.6%（29/65）和49.2% （32/65），其中強陽性表達率分別為26.2%（17/65）和21.5%（14/65），弱陽性表達率分別為18.5% （12/65）和27.7%（18/65），陰性表達率分別為55.4% （36/65）和50.8%（33/65）；有浸潤與無浸潤患者比較，VEGF總體陽性表達率比較差異有統計學意義（字2=10.264，P＜0.05），強陽性表達率和弱陽性表達率比較差異均無統計學意義（字2=2.633、3.350，P＞0.05）；SLeX總體陽性表達率、強陽性表達率之間差異均有統計學意義（字2=24.045、12.963，P＜0.05），弱陽性表達率之間差異無統計學意義（字2=1.053，P＞0.05）。有淋巴結轉移患者VEGF 和SLeX總體陽性表達率分別為69.9%（65/93）和89.2%（83/93），其中強陽性表達率分別為38.7% （36/93）和50.5%（47/93），弱陽性表達率分別為31.2%（29/93）和38.7%（36/93），陰性表達率分別為30.1%（28/93）和10.8%（10/93）；無淋巴結轉移患者VEGF和SLeX總體陽性表達率均為46.5% （33/71），其中強陽性表達率分別為26.8%（19/71）和22.5%（16/71），弱陽性表達率分別為19.7% （14/71）和23.9%（17/71），陰性表達率均為53.5% （38/71）；有淋巴結轉移與無轉移患者比較，VEGF總體陽性表達率比較差異有統計學意義（字2=9.178、P＜0.05），強陽性表達率和弱陽性表達率比較差異均無統計學意義（字2=2.579、2.736，P＞0.05）；SLeX總體陽性表達率、強陽性表達率比較差異均有統計學意義（字2=35.574、13.345，P＜0.05），弱陽性表達率比較差異無統計學意義（字2=3.367，P＞0.05）。見表1。

表1　VEGF和SLeX在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁組織中的表達

2.3VEGF和SLeX表達的相互關系 VEGF陽性表達的98例中SLeX陽性表達96例（98.0%），VEGF陰性表達的66例中SLeX陽性表達20例（30.3%）。癌組織中VEGF和SLeX表達呈正相關（r=0.59）。

3　討論

甲狀腺是人體重要的內分泌腺，主要功能是合成甲狀腺激素，在促進生長發育、新陳代謝、維持心血管系統功能正常運轉、提高中樞神經系統興奮性等方面具有重要作用［5-6］。甲狀腺癌系臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，從兒童到老年人均可發病，好發于30～50歲女性，其發病率近年來顯著上升并呈現低齡化趨勢，現已成為我國發病率增長最快的惡性腫瘤之一，目前在我國女性惡性腫瘤中列第5位，其發病原因與碘攝入量、激素調節、電離輻射、遺傳因素、自身免疫、社會因素等多方面原因有關［7-8］。有研究顯示，我國從實施食鹽加碘措施后，PTC發病率逐漸增高［9］。甲狀腺癌絕大部分起源于濾泡上皮細胞，按組織學分類，可分為分化型和未分化型，PTC是分化型甲狀腺癌最常見的病理類型，癌組織呈乳頭狀，間質內存在砂粒體，細胞核中可見核溝［10］。臨床實踐發現，大多數PTC組織分化較好，惡性程度較低，病情發展緩慢，患者生存期較長，但也有不少患者癌組織具有較高的局部浸潤性和區域淋巴結轉移率，早期診斷并給予適宜的治療對改善患者預后具有重要臨床意義，高頻彩超、螺旋CT等影像學檢查有助于診斷，高度懷疑者可行細針穿刺細胞學檢查［11-15］。由于PTC對放療、化療均不敏感，明確診斷后，分層個體化手術切除是首先治療措施，規范的首次手術是影響患者預后的主要因素［16-17］。

惡性腫瘤發生發展是多因素、多基因及其表達產物的共同作用，臨床病理工作中單純憑借HE染色觀察癌細胞病理組織形態常難以做到精確診斷和分型。由于甲狀腺癌發病具有隱匿性，生物學特性具有多變性，僅依靠現有影像學、病理學、細胞學等檢查均可能導致誤診，隨著分子生物學的發展，業已證實癌基因及其編碼蛋白的異常表達與腫瘤形成具有密切關系，尋找敏感性強、特異性高的腫瘤標志物協助鑒別診斷具有實際臨床意義［18-19］。近年已發現不少與PTC發生、發展、轉歸相關的腫瘤標志物，其應用價值在臨床診療中不斷得到肯定。VEGF是一種重要的促血管生成因子，也稱血管通透性因子或促血管素，其結構為亞基內及亞基間二硫鍵交聯形成的同型二聚體糖蛋白，與血小板源性生長因子有一定的同源性，可增加小靜脈與微血管的通透性，促進血管內皮細胞增殖、遷移，阻止血管內皮細胞凋亡和管腔網狀結構退化，增加血管滲透性。它在腫瘤組織中表達水平較高，可促進血管生成和腫瘤轉移［20-22］。Lewis血型決定簇抗原與配體分子選擇素（selectin），特別是與E-selectin及P-selectin的結合，與白細胞透出血管和腫瘤細胞轉移時逸出血管密切相關。SLeX是腫瘤標志物單唾液酸神經節糖苷脂CA19-9（sialyl Lewis A）的同分異構體，主要由巖藻糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰神經氨酸5個分子組成。近年研究表明，SLeX與其配體選擇素結合，通過Lewis-selectin轉移途徑，參與介導癌細胞與血管內皮細胞的黏附作用，是癌細胞浸潤及轉移過程中的重要途徑之一［23-26］。

本組資料表明，VEGF在PTC組織中的總體陽性表達率和強陽性表達率均顯著高于癌旁甲狀腺組織，差異均有統計學意義（P＜0.05），而弱陽性表達率比較差異均無統計學意義（P＞0.05），表明VEGF 在PTC中的表達大多數呈強陽性，在癌旁甲狀腺組織中表達大多數為陰性、弱陽性；SLeX在PTC組織中的總體陽性表達率、強陽性表達率和弱陽性表達率均顯著高于癌旁甲狀腺組織，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明SLeX在PTC中的表達大多數呈陽性，在癌旁甲狀腺組織中表達大多數為陰性。VEGF和SLeX在癌組織和癌旁甲狀腺組織的不同表達，證實它們在甲狀腺良惡性病變的鑒別診斷中具有較可靠的實際應用價值。在有浸潤和有淋巴結轉移患者中，VEGF總體陽性表達率、SLeX總體陽性表達率和強陽性表達率均顯著高于無浸潤和無淋巴結轉移患者，表明兩者均參與了癌細胞生長、凋亡、黏附、新生血管形成和浸潤轉移，在PTC的發生發展、浸潤轉移過程中發揮了一定作用，并且SLeX在非癌甲狀腺組織向PTC癌組織轉變過程中以及從癌組織無浸潤向有浸潤、從癌細胞無轉移向有轉移的發展過程中發揮的作用意義可能較VEGF更為突出。清除主要轉移區域的淋巴結，觀察其病理形態學特征，通過聯合監測VEGF和SLeX等腫瘤標志物的表達狀況，有助于精準評估臨床分期及病理分級。筆者還觀察到，VEGF和SLeX在PTC組織中表達呈正相關，提示它們在PTC惡性發展過程中可能具有協同調節作用。深入探討兩者在PTC浸潤、轉移過程中的作用機制，有助于深入了解其臨床病理進程，科學客觀地判斷其生物學特性、尤其是浸潤能力和轉移潛能，對評估患者預后、指導臨床綜合治療、降低復發率及轉移率等具有一定意義，也可能為PTC的靶向治療提供新途徑。

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Expressions of VEGF and SLeX in Papillary Thyroid Carcinoma and Their Relationships with Invasion and Metastasis

LI Y ong-qing，SHANG Pei-zhong，LIU Y ong，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（21）：005-009

Objective：To investigate the expressions of VEGF and SLeX in papillary thyroid carcinoma and their relationships with the potential of invasion and metastasis.Method：The expressions of VEGF and SLeX in 164 cases of papillary thyroid carcinoma and 30 cases of para-tumorous tissue were studied by EliVisionTMplus twostep immunohistochemical method.Result：The positive rates of VEGF and SLeX in papillary thyroid carcinoma were 59.8%（98/164）and 70.7%（116/164），both were significantly higher than those in para-tumorous tissue （P＜0.05）.The positive rates of VEGF and SLeX in the patients with tumor invasion were 69.7%（69/99）and 84.8%（84/99），both were significantly higher than those in without tumor invasion（P＜0.05）.The positive rates of VEGF and SLeX in the patients with lymphatic metastasis were 69.9%（65/93）and 89.2%（83/93），both were significantly higher than those in without lymphatic metastasis（P＜0.05）.There was a positive correlation between VEGF and SLeX expression（r=0.59）.Conclusion：High level expressions of VEGF and SLeX in papillary thyroid carcinoma are closely correlated with the invasive and metastasic potential.

Thyroid neoplasms； VEGF； SLeX； Invasion； Metastasis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.21.002

①中國人民解放軍第251醫院 河北 張家口 075000
②中國人民解放軍陸軍總醫院
③河北省蔚縣人民醫院

尚培中

2016-04-19） （本文編輯：程旭然）