非綜合征型感音神經(jīng)性聾患兒GJB2基因突變分析*

石之驎王沙燕張阮章

非綜合征型感音神經(jīng)性聾患兒GJB2基因突變分析*

石之驎①王沙燕②張阮章②

目的：對(duì)非綜合征型感音神經(jīng)性聾患兒的耳聾基因突變進(jìn)行具體分析，研究GJB2基因突變與相應(yīng)的特異性臨床表現(xiàn)，為耳聾患者的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷以及臨床治療提供理論基礎(chǔ)。方法：收集深圳地區(qū)遺傳性非綜合征耳聾患者100例和健康對(duì)照組50例，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和直接測(cè)序法，檢測(cè)GJB2基因的突變情況。結(jié)果：通過基因?qū)φ眨l(fā)現(xiàn)100例耳聾患者中共檢出攜帶GJB2 235delC點(diǎn)突變56例，占56%。其中，26例為純合性突變，30例為雜合性突變。結(jié)論：GJB2基因突變是非綜合征型感音神經(jīng)性聾人群重要的分子病因之一，GJB2基因最為常見的突變類型是235delC，對(duì)GJB2基因進(jìn)行臨床檢測(cè)具有重大意義。

耳聾； GJB2基因； 基因突變； PCR擴(kuò)增； 限制性內(nèi)切酶酶切分析

Mutation Analysis of GJ B2 Gene in Children with Non-syndrome type Neurosensory Deafness

First-author’s address：The Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518112，China

由于家族遺傳和多種生存因素的影響，感音神經(jīng)性耳聾成為高發(fā)率疾病之一，根據(jù)產(chǎn)生原因可分為遺傳性耳聾與非遺傳性耳聾。通過研究發(fā)現(xiàn)，作為常見的遺傳性疾病之一，遺傳性耳聾主要由多種相應(yīng)的基因突變導(dǎo)致［1-3］。遺傳性耳聾又細(xì)分為綜合征耳聾（syndromic hearing loss， SHI）和非綜合征耳聾（non-syndromic hearing loss，NSHL）［4］，其中，經(jīng)過多年臨床研究發(fā)現(xiàn)，NSHL主要通過常染色體隱性遺傳，占79%，由GJB2（gap junction beta2）基因突變所導(dǎo)致的重度及極重度語前聾占其中的51%［14］。筆者通過對(duì)非綜合征型感音神經(jīng)性聾患兒的耳聾基因突變進(jìn)行具體分析，研究GJB2基因突變與相應(yīng)的特異性臨床表現(xiàn)，從而為耳聾患者的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集深圳地區(qū)遺傳性非綜合征耳聾患者100例和健康對(duì)照組50例，提取DNA，利用PCR擴(kuò)增及限制性內(nèi)切酶酶切分析初篩GJB2 235delC突變者，然后再進(jìn)行DNA直接測(cè)序。

1.2方法

1.2.1DNA制備 使用試劑盒提取DNA，根據(jù)試劑盒中的說明書步驟進(jìn)行DNA提取，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的適量DNA進(jìn)行定量和純度檢測(cè)，余量放-60 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 可以通過上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。A片段中的正向引物序列為Cx26AF：5’-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC-3’，反向引物序列 為Cx26AR：5’-GCCTTCGATGCGGACCTTC-3’；B片段中的正向引物序列為Cx26BF：5’-CCGGAGACATGAGAAGAAGAG-3’，反向引物序列為Cx26BR：5’-TGAGCACGGGTTGCCTCATC-3’［15］。

1.2.3235delC 酶切檢測(cè) 通過PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA編碼區(qū)的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物20μL加入限制性內(nèi)切酶ApaI（MBI公司）2.5μL，相應(yīng)的緩沖液3μL加雙重蒸餾水至總體積30μL。2%瓊脂糖凝膠電泳。正常PCR產(chǎn)物中有ApaI酶切位點(diǎn)GGGCCC，可被酶切為155 bp和267 bp兩條帶；如有235delC突變，酶切位點(diǎn)就會(huì)消失；如為純合突變，其PCR產(chǎn)物不被酶切，僅有一條442 bp的條帶；如為雜合突變，則其中一條DNA鏈被酶切為155 bp和267 bp兩條帶，另一條DNA鏈不被消化，即會(huì)出現(xiàn)三條帶：422 bp、155 bp和267 bp。

1.2.4DNA測(cè)序 對(duì)酶切反應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，再作Cycle Sequencing反應(yīng)。反應(yīng)過程中的實(shí)驗(yàn)條件為95 ℃1 min，95 ℃變性10 s，5 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，循環(huán)25次［16］。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行醋酸鈉/酒精純化，用ABI377測(cè)序儀進(jìn)行直接測(cè)序（正反向測(cè)序），通過DNAstar軟件的SeqMan分析測(cè)序結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1臨床資料分析 對(duì)100例耳聾患者進(jìn)行純音測(cè)聽檢查、聽性腦干反應(yīng)檢查。聽性腦干反應(yīng)檢查結(jié)果與純音測(cè)聽檢查結(jié)果相符，見表1。

表1　100例耳聾患者純音測(cè)聽結(jié)果

2.2酶切結(jié)果 對(duì)100例感音神經(jīng)性耳聾患兒和對(duì)照組樣本進(jìn)行酶切反應(yīng)，觀察并查出GJB2 235delC位點(diǎn)突變。對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳處理后發(fā)現(xiàn)：100例耳聾患者中三條條帶（853 bp、467 bp和300 bp）者3例，說明存在GJB2 235delC雜合突變；一條條帶（300 bp）者2例，說明GJB2 235delC純合突變，其余為兩條條帶（155 bp和267 bp），說明無235delC 突變，見圖1。

圖1　235delC酶切圖

2.3測(cè)序結(jié)果 通過對(duì)酶切結(jié)果呈陽性樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA直接測(cè)序，共檢出攜帶GJB2 235delC點(diǎn)突變56例，占56%。其中，26例為純合突變，30例為雜合突變，與酶切結(jié)果差異較小，見圖2。

圖2　測(cè)序圖

3　討論

GJB2基因全長(zhǎng)為4804 bp，編碼區(qū)為678 bp，主要由兩外顯子組成，即一個(gè)外顯子1（exon1）和一個(gè)長(zhǎng)蛋白編碼外顯子2（exon2），且編碼區(qū)主要存在于外顯子2上［17］。GJB2基因編碼產(chǎn)物為縫隙連接蛋白Connexin-26（Cx26），Cx26為跨膜蛋白，含5類結(jié)構(gòu)域：N端結(jié)構(gòu)域，2個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)連接結(jié)構(gòu)域。Cx26蛋白在細(xì)胞縫隙連接處以六聚體的形式形成穿膜通道，分布于耳蝸的血管紋、基底細(xì)胞、螺旋緣凸、神經(jīng)感覺上皮及耳蝸傳導(dǎo)纖維等處，是細(xì)胞間電解質(zhì)、第二信使和代謝物質(zhì)的重要通道，在信息傳遞和物質(zhì)交換中發(fā)揮重要作用［18］。

非綜合征性感音神經(jīng)性耳聾主要由于GJB2基因突變引起，目前，經(jīng)過臨床研究，在GJB2基因中已發(fā)現(xiàn)111中突變形式，顯性突變9種，隱性突變92種［4］。由于不同突變形式導(dǎo)致病變產(chǎn)生得原因有多種：由于起始密碼子的突變，即1A→G，將GJB2基因的起始密碼從Met變成Val，但是這種突變方式不合成蛋白質(zhì)；堿基插入或缺失，如35delG，269insT，使GJB2基因發(fā)生移碼突變，Cx26蛋白的氨基酸序列發(fā)生變化，導(dǎo)致Cx26失活；基因突變后出現(xiàn)終止密碼子，如132G→A，導(dǎo)致突變后Trp（TGG）變成終止密碼子（TGA），從而終止蛋白質(zhì)的合成。同樣，由于不同的GJB2基因突變引起不同的聽力衰減程度，即使在一個(gè)家庭中，攜帶相同基因突變的個(gè)體間同樣存在顯著差異。現(xiàn)階段，雖然還無法對(duì)不同GJB2基因突變所致的臨床癥狀下結(jié)論，但一些研究發(fā)現(xiàn)基因突變引起的臨床癥狀具有明顯特征。除此之外，GJB2基因中的隱形遺傳突變有可能發(fā)生在任何部位，而顯性遺傳突變，如125delAGG，會(huì)引起輕度到重度的聽力缺失，通常還會(huì)產(chǎn)生皮膚病癥。

遺傳基因的多態(tài)性并不伴隨著相應(yīng)的遺傳性狀，主要是因?yàn)槟硞€(gè)個(gè)體DNA分子結(jié)構(gòu)的變化，并不改變基因的功能和表達(dá)性狀。通常在基因序列中，一些不參與蛋白質(zhì)合成和無重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致基因存在多態(tài)性，當(dāng)這種突變獨(dú)立產(chǎn)生作用時(shí)，并不引起疾病。相對(duì)于其他基因，GJB2基因突變的多態(tài)性表達(dá)較高，所以要明確GJB2的基因突變屬于致病突變還是多態(tài)性表達(dá)是非常有必要的。現(xiàn)階段的臨床研究表明，在GJB2基因突變中，諸如G79A、A341G、T101C等在內(nèi)的42種基因突變是多態(tài)性表達(dá)，其中仍有許多如109E-A突變等GJB2基因突變的歸類還存在許多爭(zhēng)議，這就需要更深一步的臨床研究和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證［19］。

對(duì)于生存習(xí)慣和環(huán)境不同的人群中，由GJB2基因突變?cè)斐傻幕純郝犃θ笔У挠绊懸膊槐M相同。研究發(fā)現(xiàn)，生活在北歐地區(qū)的高加索人中，將近20%的聽力缺失個(gè)體中發(fā)現(xiàn)有GJB2位點(diǎn)突變，在患語前聾聽力缺失的韓國(guó)人中為5%，以色列人為43%。在北歐猶太教徒、高加索人和加納人種中，在GJB2基因突變中，與聽力能力缺失相關(guān)且出現(xiàn)頻率較多的基因位點(diǎn)分別是35delG、167delT 和235delC。而在我國(guó)，235delC的突變情況在不同區(qū)域也不一樣，且純合子與雜合子之間的比例也有差異。研究統(tǒng)計(jì)顯示，東部235delC純合子及雜合子出現(xiàn)的次數(shù)較西部偏多；在大部分地區(qū)，235delC雜合子與純合子的比率大致相等。然而，部分區(qū)域，純合子與雜合子的比率相差較大，如北京、吉林等城市，235delC純合子頻率約是雜合子的二倍。并且在不同民族之間，235delC的突變情況也有顯著不同，如235delC等位基因突變?cè)诓刈宄霈F(xiàn)的次數(shù)相對(duì)其他民族較低，而在滿族中頻率較高［20］。

多年臨床研究發(fā)現(xiàn)，感音性耳聾主要由GJB2基因突變?cè)斐桑詫?duì)有遺傳病史的家庭進(jìn)行遺傳知識(shí)普及和教育并開展基因檢測(cè)，以及對(duì)遺傳性耳聾進(jìn)行產(chǎn)前診斷是非常有必要的。

人的語言形成的關(guān)鍵時(shí)期是幼兒語前期，因此在新生兒的常規(guī)聽力檢查中，應(yīng)增加GJB2基因檢測(cè)，便于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)以及早治療。對(duì)于一些產(chǎn)前診斷中，已經(jīng)明確感音性耳聾的前提下，還可以通過遺傳學(xué)指導(dǎo)和手段干預(yù)下，進(jìn)行二次生育，避免再次生育由于遺傳基因突變致聾的患兒。由于GJB2基因突變的類型多且雜，可通過對(duì)非綜合征性遺傳性耳聾患者的GJB2基因進(jìn)行直接測(cè)序，在診斷出大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)突變的同時(shí)，查出新的基因突變，為臨床診斷、治療提供理論支持和實(shí)驗(yàn)研究。最后，相對(duì)遺傳性聾這一大類疾病來說，上述已經(jīng)明確疾病表型和致病基因的病種只是其中很少一部分，遺傳性聾致病基因多且功能復(fù)雜，要實(shí)現(xiàn)從基因篩查到最終診斷的突破任重道遠(yuǎn)，大部分遺傳性聾的明確基因診斷還依賴于未來臨床診斷水平、分子生物學(xué)水平以及生物信息學(xué)發(fā)展。隨著聽力學(xué)、影像學(xué)等臨床診斷技術(shù)不斷提高，同時(shí)分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展使得基因篩查和檢測(cè)不但變得越來越便捷和可靠，而且能夠得到的遺傳數(shù)據(jù)也越來越大，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，這些大量篩查數(shù)據(jù)和成果的臨床指導(dǎo)價(jià)值也將逐步清晰化，屆時(shí)必將會(huì)有更多的遺傳性聾能夠完成明確的基因診斷［21］。

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SHI Zhi-lin，WANG Sha-yan，ZHANG Ruan-zhang.//Medical Innovation of China，2016，13（21）：021-024

Objective：To analyze GJB2 gene mutations in patients with non-syndrome children with neurosensory deafness，and ravel specific clinical manifestations of deafness gene and corresponding and provide a theoretical basis for genetic counseling，prenatal diagnosis and clinical treatment.Method：GJB2 gene was detected by polymerase chain reaction and direct sequencing of 50 patients with hereditary non syndrome deafness in Shenzhen and 100 healthy controls.Result：The 100 patients with 235delC GJB2 point mutations were detected by polymerase chain reaction and direct sequencing in 56 patients.Among them，26 cases were homozygous mutation，and 30 cases were heterozygous mutation.Conclusion：GJB2 gene mutation is one of the most important molecular causes of non syndrome children with nervous deafness，and the most common mutation type of GJB2 gene is 235delC，and itis of great significance for clinical detection of GJB2 gene.

Deafness； GJB2 gene； Gene mutation； PCR amplification； Restriction enzyme digestion analysis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.21.006

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（醫(yī)療衛(wèi)生類）資助（200902004）
①?gòu)V東省深圳市第三人民醫(yī)院 廣東 深圳 518112
②廣東省深圳市人民醫(yī)院

石之驎

2016-01-16） （本文編輯：程旭然）