異氟烷麻醉后老年大鼠學習/記憶功能改變與腦海馬CA1區谷氨酸水平及受體變化的關系

曲向東　徐誠實　曲智俊　周海濱　張麗娜

(北京積水潭醫院麻醉科，北京　100035)

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異氟烷麻醉后老年大鼠學習/記憶功能改變與腦海馬CA1區谷氨酸水平及受體變化的關系

曲向東徐誠實曲智俊周海濱張麗娜1

(北京積水潭醫院麻醉科，北京100035)

目的探討異氟烷麻醉后老年大鼠學習/記憶功能障礙模型中海馬CA1區谷氨酸濃度的動態變化對術后認知功能障礙(POCD)的影響機制。方法將111只老年大鼠(≥18月齡)隨機分為微透析組(n=38)和Western印跡組(n=73)。將兩組大鼠都進一步分為對照組(n=6、10，不接受迷宮訓練，吸入空氣但不接受異氟烷麻醉)，空氣吸入組(n=7、15，接受迷宮訓練，吸入空氣但不接受麻醉)以及異氟烷麻醉組(n=25、48，接受迷宮訓練和異氟烷麻醉)。應用Morris水迷宮測試接受異氟烷麻醉的大鼠麻醉前后的迷宮成績，并以此為依據將異氟烷麻醉組大鼠進一步分為認知功能明顯受損亞組(MIS)和認知功能無明顯受損亞組(NMIS)。應用大鼠腦微透析系統收集不同時間點微透析組大鼠腦海馬CA1區的腦脊液。腦脊液中的谷氨酸濃度應用高效液相色譜法(HPLC)進行測定，而興奮性谷氨酸受體轉運體(EAAT)1、EAAT2、N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR)1、NMDAR2A/B、α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體(AMPAR)以及tau蛋白表達水平的變化通過Western印跡測定。結果接受異氟烷麻醉的大鼠學習/記憶功能明顯受損的發生率為12.0%。異氟烷麻醉組大鼠麻醉過程中的谷氨酸濃度均明顯低于對照組和空氣吸入組(P=0.015和0.011)。麻醉后24 h時，MIS亞組谷氨酸水平明顯高于對照組和NMIS亞組(P=0.029，P<0.01)。麻醉后首次水迷宮訓練時，MIS組谷氨酸濃度明顯高于NMIS組(P=0.032)。麻醉48 h以后各個時間點，MIS亞組谷氨酸水平均明顯高于其余三組。Western印跡組認知功能明顯受損的大鼠EAAT1的表達明顯高于其余3個亞組(P=0.026,0.02，0.032)，而該組各亞組GLT-1、NMDAR1、NMDAR2A/B、AMPAR以及tau蛋白的表達水平均無明顯差異。結論異氟烷麻醉學習/記憶功能障礙大鼠模型中海馬CA1區谷氨酸水平呈持久性升高，可能與麻醉藥引發的學習/記憶功能障礙的病理生理過程有關。而這可能進一步引起EAAT1的表達增加，但EAAT2、NMDAR1、NMDAR2A/B 、AMPAR和tau蛋白等無明顯變化。

谷氨酸；異氟烷；學習/記憶功能受損；Morris水迷宮；谷氨酸轉運體；谷氨酸受體

作為腦內最豐富且最重要的興奮性神經遞質，是否在術后認知功能障礙(POCD)發病過程中也伴有谷氨酸濃度水平的變化及其變化趨勢至今仍不清楚。本實驗通過觀察異氟烷麻醉和水迷宮訓練后老年大鼠腦海馬CA1區谷氨酸濃度的動態變化，探討異氟烷引發的認知功能受損與谷氨酸濃度以及谷氨酸受體之間的關系。

1　材料和方法

1.1材料與分組將111只老年大鼠(≥18月齡)隨機分為微透析組(n=38)和Western印跡組(n=73)。將兩組大鼠都進一步分為對照組(n=6、10，不接受迷宮訓練，吸入空氣但不接受異氟烷麻醉)，空氣吸入組(n=7、15，接受迷宮訓練，吸入空氣但不接受麻醉)以及異氟烷麻醉組(n=25、48，接受迷宮訓練和異氟烷麻醉)。應用Morris水迷宮測試接受異氟烷麻醉的大鼠麻醉前后的迷宮成績，并以此為依據將異氟烷麻醉組大鼠進一步分為認知功能明顯受損亞組(MIS)和認知功能無明顯受損亞組(NMIS)。應用大鼠腦微透析系統收集不同時間點微透析組大鼠腦海馬CA1區的腦脊液。腦脊液中的谷氨酸濃度應用高效液相色譜法(HPLC)進行測定，而興奮性谷氨酸受體轉運體(EAAT)1、EAAT2、N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR)1、NMDAR2A/B、α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體(AMPAR)以及tau蛋白表達水平的變化通過Western印跡測定。詳見本文的前期研究〔1〕。

1.2Western印跡蛋白測定將海馬組織稱重后置入乙二胺四乙酸(EDFA)緩沖液中研磨均勻。4℃下將混合液12 000 r/min離心10 min后，分離上清液并應用Bradford比色法測定其蛋白濃度。將內含50 μg總蛋白的上清液加入10%聚丙烯酰胺凝膠加樣孔中進行電泳，后將凝膠上的蛋白在適當電流下轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。應用溶解于Tris鹽酸緩沖液(TBST)的5%脫脂奶粉封閉后，PVDF膜進行一抗孵育，各抗體濃度為：β-actin，1∶4 000,sc-1616-R,Santa Cruz Biotechnology；興奮性谷氨酸受體轉運體(GLAST)，1∶2 500,ab416,Abcam,Cambridge,MA,USA；GLT-1，1∶2 000,ab41621,Abcam,Cambridge,MA,USA；N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR1)，1∶1 000,AB9864,Millipore；NMDAR2A/B，1∶500,AB1548,Millipore；α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體(AMPAR)，1∶2 500,Ab1504,Millipore；T-Tau(1∶1 000,sc-32274,Santa Cruz Biotechnology。然后將PVDF膜放入4℃冰箱過夜。將膜用TBST進行洗脫并用經過辣根過氧化物酶標記的抗兔或抗鼠二抗在室溫下孵育1 h。應用增強化學發光法(ECL)試劑盒(Santa Cruz)對蛋白進行免疫熒光檢測并在暗室中進行曝光。應用Image-Pro Plus 6.0軟件對曝光過的膠片進行掃描分析，并用β-actin對待測指標條帶的表達水平進行標準化處理。

1.3統計學方法應用SPSS11.5軟件進行方差分析、雙變量相關分析。

2　結　果

2.1水迷宮成績測試結果

2.1.1麻醉前行為學測試結果麻醉前各個時間點各亞組之間ELP均無統計學差異。麻醉后行為學測試成績：NMIS亞組與空氣吸入組在各個時間點上ELP均無統計學差異，而MIS亞組在各個時間點上ELP與空氣吸入組和NMIS亞組相比差異顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1　Western印跡組麻醉前后行為學測試成績

2.1.2行為學測試記憶能力麻醉前和麻醉后在定位航行實驗測試完畢2 d后進行空間探索實驗以測試大鼠對平臺空間位置的記憶能力。將大鼠放入撤區平臺的水池中90 s觀察在此期間內大鼠穿越目標區域的次數。微透析組和Western印跡組各組麻醉前結果無統計學差異。麻醉后微透析組MIS亞組在目標區域內的時間明顯低于空氣吸入組和NMIS亞組(P=0.013，0.017)，而NMIS亞組與空氣吸入組之間無明顯統計學差異(圖2)。Western印跡組MIS亞組麻醉后在目標區域內的時間明顯低于空氣吸入組和NMIS亞組(P=0.012，0.034)，而NMIS亞組與空氣吸入組之間無明顯統計學差異。然而，微透析組和Western印跡組認知功能無明顯損害的大鼠在目標區域內的時間與空氣吸入組均無明顯統計學差異。微透析組：麻醉前接受行為學測試的大鼠在目標區域滯留時間無明顯差異，而麻醉后MIS亞組在目標區域滯留時間明顯低于空氣吸入組和NMIS亞組(P<0.05)。Western印跡組：麻醉前接受行為學測試的大鼠在目標區域滯留時間無明顯差異，而麻醉后MIS亞組在目標區域滯留時間明顯低于空氣吸入組和NMIS亞組(P<0.05)。微透析組和Western印跡組接受行為學測試的大鼠麻醉前后游泳速度均無明顯統計學差異(圖3)。

圖2　麻醉前后微透析組和Western印跡組大鼠定位航行試驗在目標區域的時間

圖3　微透析組和Western印跡組麻醉前后行為學測試每天平均游泳速度

2.2谷氨酸相關蛋白的表達(Western印跡組)MIS亞組EAAT1的表達水平明顯高于對照組、空氣吸入組和NMIS亞組(P值分別為0.026,0.020和0.032)，而其余三亞組之間相比較則無明顯統計學差異。EAAT2,AMPAR,NMDAR1、NMDAR2A/B和tau蛋白的表達水平各亞組之間無明顯統計學差異。見圖4。MIS亞組EAAT1表達水平明顯高于對照組、空氣吸入組和NMIS亞組(P=0.026，0.02，0.032)。而其他指標各組之間均無明顯統計學差異。見圖4，圖5。

1～6：GLAST、GLT-1、AMPAR、NMDAR1、NMDAR2A/B、tau圖4　Western印跡組谷氨酸相關蛋白表達

1～4：對照組、空氣吸入組、NMIS組及MIS組圖5　EAAT1,EAAT2,AMPAR,NMDAR1和NMDAR2A/B相對表達水平及Western印跡條帶

3　討　論

該研究有兩項主要發現：(1)異氟烷引起的老年大鼠認知功能受損伴有腦海馬CA1區谷氨酸濃度的持續性升高〔3〕；(2)異氟烷誘發的老年大鼠認知功能受損模型中腦海馬GLAST表達增加，而谷氨酸運轉蛋白(GLT-1)、 NMDAR1,NMDAR2A/B和AMPAR等谷氨酸相關蛋白的表達無明顯變化。由于POCD的患者的臨床表現與早期阿爾茨海默病(AD)類似，而且POCD可能進一步發展為AD，因此有人認為POCD是AD的一種前期病變，且POCD與AD的病理機制類似〔2〕。谷氨酸被視為哺乳動物中樞神經系統中最重要的興奮性經遞質〔3〕。正常情況下谷氨酸在長時程增強(LTP)有重要作用，而LTP被認為是學習和記憶過程的基礎，大腦海馬LTP是記憶形成和鞏固過程中神經元活動的客觀指標〔4〕。然而，谷氨酸是一把雙刃劍，在特定情況下可以從一種正常的神經遞質轉變為一種神經毒性物質〔5〕。與以上研究不同的是，對大鼠認知功能障礙模型進行了連續微透析，發現在異氟烷引發的認知功能受損中谷氨酸濃度持續明顯升高，該趨勢從麻醉后24 h開始升高至麻醉后84 h達到高峰，隨之谷氨酸濃度開始下降但仍處于高于其他兩組的水平并一直持續到實驗結束。更為重要的是，麻醉后谷氨酸濃度升高與異氟烷麻醉后大鼠的迷宮成績之間有明顯相關。也就是說，谷氨酸濃度越高，學習記憶能力越差〔1〕。正如Lipton SA等的觀點，谷氨酸的興奮性毒性作用是以持續的、輕度的、慢性的、緊張性的方式而非位相性的方式起作用的〔6〕。正因為神經元受損，因此細胞內的谷氨酸外流至細胞外間隙進而引發腦脊液中谷氨酸濃度升高。而此持續緩慢的谷氨酸濃度輕度升高可能是異氟烷引發的認知功能受損的早期表現。雖然GLAST和GLT-1的表達增加與許多神經疾病有關，包括AD或AD樣病變，但是這些研究成果之間仍然存在爭議。最近研究發現，有報道稱皮層下白質EAAT1和EAAT2在缺血初始階段表達水平升高而在隨后的再灌注階段表達水平明顯降低〔7〕。研究發現在AD早期階段EAAT1和EAAT2的表達水平也有明顯升高〔8〕。本實驗中發現GLAST的表達水平明顯升高，而GLT-1的表達水平則無明顯變化。由于兩種興奮性氨基酸轉運體的分布情況不同，GLAST在海馬組織中也有中等程度的分布。本文認為引起海馬組織中GLAST表達升高的原因主要有兩個：①GLAST較GLT-1對于谷氨酸更加敏感，因此，GLAST對于高谷氨酸濃度的反應要早于GLT-1；②GLT-1在腦組織內含量極為豐富，其含量約占腦細胞膜蛋白含量的1%。因此，雖然在本試驗中也發現GLT-1的表達水平升高，但是由于其基數大，因此其表達水平的變化沒有GLAST明顯。雖然GLAST的表達升高令人費解，但是其可能表明這是神經系統對高谷氨酸濃度的一種保護性反應機制，以減輕興奮毒性效應對于神經系統的損傷。海馬GLAST的表達對于海馬谷氨酸穩態的維持至關重要。反義敲除GLAST會引起海馬中谷氨酸濃度的異常升高，而且GLAST還可以提高腦組織對谷氨酸興奮毒性的抵抗能力〔9〕。因此，考慮到微透析實驗中谷氨酸濃度的持續性升高，將GLAST的表達升高歸因于海馬組織中的高谷氨酸濃度。本文也認為，在異氟烷引發的認知功能障礙中GLAST表達水平的升高是谷氨酸能系統的早期變化。

1徐誠實，曲向東，吳安石，等.異氟烷麻醉后老年大鼠學習/記憶功能改變與腦海馬CA1區谷氨酸水平變化的關系〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(19):5417-21.

2Ritchie K,Carriere I,Ritchie CW,etal.Designing prevention programmes to reduce incidence of dementia:prospective cohort study of modifiable risk factors〔J〕.BMJ,2010；341(9739):c3885.

3Xie Z,Culley DJ,Dong Y,etal.The common inhalation anesthetic isoflurane induces caspase activation and increases amyloid beta protein level in vivo〔J〕.Ann Neurol,2008;64(6):618-27.

4Planel E,Richter KE,Nolan CE,etal.Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia〔J〕.J Neurosci,2007;27(12):3090-7.

5Sattler R,Tymianski M.Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death〔J〕.Mol Neurobiol,2001;24(1-3):107-29.

6Lipton SA,Rosenberg PA.Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders〔J〕.N Engl J Med,1994;330(9):613-22.

7Xue B,Chen EC,He N,etal.Integrated regulation of AMPA glutamate receptor phosphorylation in the striatum by dopamine and acetylcholine〔J〕.Neuropharmacology,2016;3908(16):3014.

8Litim N,Morissette M,Di Paolo T.Metabotropic glutamate receptors as therapeutic targets in Parkinson's disease:an update from the last 5 years of research〔J〕.Neuropharmacology,2016;3908(16):3010.

9Seo S,Liu P,Leitch B.Spatial learning-induced accumulation of agmatine and glutamate at hippocampal CA1 synaptic terminals〔J〕.Neuroscience,2011;192:28-36.

〔2015-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.015

張麗娜(1977-)，女，副主任醫師，主要從事麻醉與腦保護研究。

曲向東(1976-)，男，主治醫師，主要從事麻醉與腦保護研究。

R614.2

A

1005-9202(2016)14-3384-04；

1青島市市立醫院麻醉科