慢性應激和組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉對大鼠空間學習和記憶能力的影響及其作用機制

魏艷霞

(南陽市中心醫院，河南　南陽　473003)

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慢性應激和組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉對大鼠空間學習和記憶能力的影響及其作用機制

魏艷霞

(南陽市中心醫院，河南南陽473003)

目的觀察慢性應激和組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉對大鼠空間學習和記憶能力的影響及其作用機制。方法將58只雄性SD大鼠隨機地分為對照+生理鹽水組、對照+丁酸鈉組、慢性應激+生理鹽水組及慢性應激+丁酸鈉組。慢性應激組給予連續21 d制動應激，應激結束后將每組大鼠隨機選出8只采用Y迷宮及Morris水迷宮檢測空間學習、記憶能力，余下大鼠采用 蛋白質免疫印跡(WB)檢測海馬組蛋白H3、H4乙酰化和反應元件結合蛋白(p-CREB)、腦源性神經營養因子(BDNF)的表達變化。結果慢性制動應激的大鼠較未應激大鼠體重增長緩慢(P<0.01)。在Y迷宮測試中，各組大鼠進入各個臂次數百分比差異無統計學(P>0.05)；各組大鼠在三個臂的停留時間百分比的分析，組間比較無統計學差異(P>0.05)，而組內分析發現，對照+生理鹽水組、對照+丁酸鈉組和慢性應激+丁酸鈉組在新異臂的停留時間遠多于其他兩臂(P<0.05)；此外，單因素方差分析顯示慢性應激+生理鹽水組在各個臂的總穿越次數較對照+生理鹽水組多明顯減少(P<0.05)。水迷宮定位導航試驗實驗顯示，各組大鼠平均潛伏期組內、組間均差異顯著；定位導航試驗第2天，對照+丁酸鈉組平均潛伏期較對照+生理鹽水組有明顯增高(P<0.05)；而慢性應激+生理鹽水組大鼠在訓練第3天的平均潛伏期顯著高于對照+生理鹽水組，同時慢性應激+丁酸鈉組找尋找平臺的時間也明顯低于慢性應激+生理鹽水組(P<0.05)。水迷宮空間探索試驗中，大鼠在目標象限游泳時間、距離百分比及穿越平臺區域的次數均無顯著差異(P>0.05)；而對大鼠在目標象限及目標相反象限的游泳時間進行統計發現，組內有顯著差異(P<0.01)，而組間差異不明顯(P>0.05)；慢性應激+生理鹽水組大鼠在兩個區域的游泳時間無明顯差異，而其余三組大鼠在目標象限的游泳時間均顯著高于其在目標相反象限的時間(P<0.01)。WB結果提示慢性應激+生理鹽水組大鼠acH3蛋白含量的低于對照+生理鹽水組(P<0.05)，而acH4蛋白含量雖有降低趨勢，卻無統計學差異；慢性應激+丁酸鈉組與慢性應激+生理鹽水組大鼠相比較，acH3、acH4蛋白水平均明顯增加(P<0.01)。慢性應激+生理鹽水組大鼠海馬p-CREB水平明顯低于對照+生理鹽水組(P<0.01)，其BDNF含量也同樣低于對照+生理鹽水組(P<0.05)；慢性應激+丁酸鈉組與慢性應激+生理鹽水組大鼠相比p-CREB、BDNF含量均有明顯增加(P<0.01、P<0.05)；對照+丁酸鈉組組大鼠相對于對照+生理鹽水組BDNF含量有所減少(P<0.05)，而p-CREB含量則無明顯變化。結論慢性應激可減緩大鼠體重增長，損害其空間學習和記憶水平，而丁酸鈉可以對應激大鼠的學習記憶起保護作用，其可能是通過影響海馬組蛋白乙酰化及認知相關蛋白表達而實現。

慢性應激；丁酸鈉；空間學習記憶

多種神經遞質及認知相關蛋白表達的改變參與了慢性應激所致認知損害進程〔1～3〕。丁酸鈉作用于離體的大鼠腦片時可顯著增加慢性不可預知應激模型大鼠海馬區域的組蛋白乙酰化水平，尤其是H4 的乙酰化水平較給予丁酸鈉的正常大鼠的腦片有顯著增加〔4〕。慢性應激可能通過增強HDAC 的作用，引起大鼠海馬組蛋白乙酰化水平下降，減低認知相關蛋白的轉錄，導致神經突觸結構和功能受損，出現認知功能損害〔5〕，因此，上調大鼠海馬組蛋白乙酰化水平對慢性應激大鼠認知功能損害的作用值得期待。本研究擬觀察其對大鼠海馬組蛋白乙酰化水平及認知相關分子表達的變化。

1　材料和方法

1.1材料實驗動物：本實驗選用雄性SPF 級Spraque-Dawley 大鼠56 只，體重(200±20)g，由四川大學動物實驗中心提供，動物合格證號SCXK(JII19)。大鼠飼養于SPF環境，每籠4 只，室溫(22±2)℃，濕度50%～55%，晝夜節律12 h/12 h。大鼠可自由飲食飲水，在適應環境1 w后開始實驗，每周稱重一次。

主要儀器和試劑：2K15高速冷凍離心機，Sigma公司；752-P紫外分光光度計，上海現科儀器有限公司；PL-203電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；DYCZ-24D垂直電泳槽，北京六一儀器廠；DYCZ-40D電轉印系統，北京六一儀器廠；WD-9405A脫色搖床，北京六一儀器廠；79-1磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司；BCD-186 冰箱，西門子；ECL Plus顯色試劑盒，安瑪西亞公司；PVDF 膜，Millipore 公司；聚丙烯酰胺，Sigma 公司；SDS，Sigma公司；Tris-base，Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)，Roche公司；蛋白marker(10～170 kD)，Fermentas 公司；β-actin，Santa 公司；Anti-acetyl Histone H4(Lys5/8/12/16)，Millipore 公司；Anti-acetyl Histone H3(Lys14)，Millipore 公司；Anti-phospho-CREB，Millipore 公司；Anti-BDNF，Millipore 公司；其他試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1實驗分組隨機分為對照生理鹽水組、對照丁酸鈉組、應激生理鹽水組及應激丁酸鈉組，每組各14只，各組平均體重差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2.2給藥方案慢性應激組大鼠均給予21 d連續制動應激，對照組均飼養于標準環境，大鼠統一在實施應激前半小時給8.4 ml/100 g 生理鹽水或丁酸鈉溶液腹腔注射。腹腔注射前用碘酒消毒注射區域皮膚，每天更換注射器。本實驗生理鹽水均采用醫療注射用生理鹽水，丁酸鈉購于美國Sigma公司，避光保存，每日注射前新鮮配制，用生理鹽水配制成濃度為10%的溶液，搖勻后使用。

1.2.3慢性制動應激模型慢性應激裝置參照文獻〔6〕自制。由薄鐵皮制成無蓋盒子，上有可自由開合的金屬網蓋，盒內平均分隔為四個長方形格子(20 cm×7.5 cm×8 cm)，每格可放一只大鼠。放入大鼠后可根據動物的大小加入合適的長條形木板，以更好的限制大鼠的活動。應激組大鼠在標準環境中采用該裝置給予連續21 d每天6 h(10：30～16：30)的慢性制動應激。應激結束后徹底沖洗應激裝置，晾干備用。

1.2.4Y迷宮測試關閉新異臂入口處的活動門，將動物由起始臂起始端放入迷宮，任其自由探索起始臂及臂15 min；結束4 h之后，打開活動門，將動物由起始臂放入迷宮，任其自由探索三個臂5 min。實驗在同樣的光線下進行，避免晝夜節律對動物活動度的影響。在每次實驗后采用酒精擦洗實驗裝置以避免氣味對動物的影響。動物放入迷宮后，測試者迅速離開，避免人為干擾。整個實驗過程由迷宮正上方的攝像頭記錄，由專業軟件分析。

1.2.5Morris水迷宮測試每天將大鼠由4 個入水點分別放入水中一次，入水點的先后順序隨機產生。記錄找到平臺的時間，即逃避潛伏期作為大鼠學習水平的依據。大鼠每次尋找平臺的時間設定為60 s，時間結束后用木棍引導尚未找到平臺的大鼠到達平臺，未找到平臺的大鼠的潛伏期記錄為60 s。所有大鼠上平臺后停留20 s，使其通過觀察周圍環境記住平臺的位置，學習結束后放回籠中。本實驗中定位導航試驗共進行5 d，所有訓練在每天同一時間完成，在第7天進行空間探索試驗：撤掉水中的平臺，選擇SW 作為入水點，記錄大鼠在30 s內的游泳軌跡，軟件可測算大鼠在四個象限游泳的速度、距離、時間等，也可記錄大鼠在之前平臺區域的穿越次數，以上數據均可表示大鼠對原來水下平臺的記憶能力。

1.2.6WB檢測在應激結束后間隔一天，即實驗第23 d進行組織取材。采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(350 mg/kg)，大鼠對疼痛刺激無反應后迅速斷頭，用小止血鉗小心剝離顱骨，取出腦組織置于冰上，快速分離出大鼠雙側海馬組織，分別置于標記好的凍存管后立即放入液氮中暫存，待所有組織取完后統一放入-80℃冰箱中保存，隨后進行WB檢測。取100 mg/ml BSA，室溫融化后用生理鹽水稀釋至1 mg/ml；取離心管，分別加入相應試劑，混勻后，室溫放置2 min，用分光光度計比色分析，制作標準曲線；將1 μl待測蛋白加入900 μl Bradford和99 μl生理鹽水，混勻后在595 nm處檢測吸光度。根據標準曲線計算出樣本的蛋白濃度。

1.2.7SDS-PAGE電泳將兩塊清潔玻璃板對齊后放入夾中卡緊；加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。待膠充分凝固后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干；配5%的濃縮膠，加入TEMED后充分混合，將剩余空間灌滿，然后將梳子插入濃縮膠中，待膠凝固后垂直將梳子拔出。用去離子水沖洗后將加樣孔中液體用濾紙吸去；根據所測蛋白含量，計算含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取蛋白標本至離心管中，加入適量蛋白上樣緩沖液。上樣前沸水浴5 min使蛋白變性；加入足量電泳液后開始電泳。濃縮膠電壓為75 V；分離膠電壓為120 V，當溴酚藍前沿電泳到分離膠底部時終止電泳，進行轉膜。

1.2.8免疫反應將轉好的PVDF膜置于室溫下脫色搖床上的封閉液中，封閉1 h；用TBST 溶解的5%脫脂牛奶將一抗稀釋1 000倍，將PVDF膜蛋白朝下放于抗體液面，趕出氣泡，4℃過夜。用TBST在室溫下脫色，并在搖床上洗3次，每次5 min；將二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST在室溫脫色搖床上洗3次，每次5 min。

1.3統計學分析采用GraphPad Prism 5.0 軟件行Two-way ANOVA、Bonferroni post-test和One-way ANOVA檢驗。

2　結　果

2.1體重變化各組大鼠在實驗過程中體重均平穩增長，應激前各組體重無明顯差異(P>0.05)，而從應激開始后體重差異逐漸出現。接受慢性制動應激的大鼠(應激生理鹽水組、應激丁酸鈉組)較未應激大鼠(對照生理鹽水組、對照丁酸鈉組)體重增長緩慢。與對照生理鹽水組相比，應激丁酸鈉組在第8天、第21天體重有明顯降低(P<0.01)；而應激生理鹽水組在第8、15、21天與對照生理鹽水組相比體重明顯降低(P<0.01)。對照生理鹽水組大鼠與對照丁酸鈉組相比體重略有減低，但無統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2Y迷宮試驗結果在應激結束后1 d，各組大鼠中分別隨機選出8只進行行為學測試，每組剩余6只取材用于生化指標檢測。各組大鼠進入新異臂的次數及停留時間百分比均無統計學差異(P>0.05)。各組大鼠進入各個臂次數百分比組間無顯著差異，而組內分析發現四組大鼠進入新異臂的次數均顯著高于其他兩臂(P<0.01)。而對于各組大鼠在三個臂的停留時間百分比的分析，組間分析無統計學差異(P>0.05)，組內分析發現，對照生理鹽水組、對照丁酸鈉組及應激丁酸鈉組在新異臂的停留時間遠多于其他兩臂(P<0.01)，而應激生理鹽水組在三個臂的停留時間無統計學差異(P>0.05)。單因素方差分析顯示應激生理鹽水組〔(12.25±2.31)次〕在各個臂的總穿越次數較對照生理鹽水組〔(20.04±4.16)次〕多明顯減少(P<0.05)，應激丁酸鈉組〔(14.36±1.87)次〕總穿越次數相對對照生理鹽水組和對照丁酸鈉組〔(18.41±2.79)次〕有所減少，但差異無統計學意義。見表2、表3。

表1　大鼠體重變化(g,n=14)

與對照生理鹽水組比較：1)P<0.01

表2　Y迷宮試驗停留時間結果

表3　Y迷宮試驗停留時間、次數百分比結果

與其他兩臂比較：1)P<0.05

2.3Morris 水迷宮試驗結果Two-way ANOVA 顯示各組大鼠平均潛伏期組內(F3，140=2.98)、組間(F4，140=88.45)均有統計學意義(P<0.05)。Bonferroni posttest 顯示定位導航試驗第2天，對照丁酸鈉平均潛伏期較對照生理鹽水組有明顯增高(P<0.05)；而應激生理鹽水組大鼠在訓練第3天的平均潛伏期顯著高于對照生理鹽水組(P<0.01)。見表4。One-way ANOVA 顯示，大鼠在目標象限游泳時間百分比及穿越平臺區域的次數差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5。

采用Two-wayANOVA 對各組大鼠在目標象限及目標相反象限的游泳時間進行統計，組內(F1，56=47.5，P<0.01)，而組間差異則不具有統計學意義(F3，56=0.39，P>0.05)。應激生理鹽水組大鼠在兩個區域的游泳時間無明顯差異，而其余三組大鼠在目標象限的游泳時間均顯著高于其在目標相反象限的時間(P<0.01)。見表6。

2.4海馬acH3 和acH4 蛋白含量應激生理鹽水組大鼠acH3 蛋白含量的低于對照生理鹽水組(t=2.73，P<0.05)，而acH4 蛋白含量雖有降低趨勢但卻無統計學意義；應激丁酸鈉組與應激生理鹽水組大鼠相比較，acH3、acH4 蛋白水平均明顯增加(P<0.01)；對照丁酸鈉組大鼠則與對照組蛋白表達水平無明顯差異。見表7。

表4　Morris 水迷宮試驗潛伏期結果

與對照生理鹽水組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

表5　Morris 水迷宮試驗平臺穿越結果

表6　Morris 水迷宮游泳時間結果

與同組目標相比較：1)P<0.01

表7　大鼠海馬acH3 和acH4 蛋白含量

與對照生理鹽水組比較：1)P<0.05；與對照丁酸鈉組比較：2)P<0.01

2.5海馬p-CREB、BDNF 含量應激生理鹽水組大鼠海馬p-CREB 水平明顯低于對照生理鹽水組(P<0.01)，其BDNF 含量也低于對照生理鹽水組(P<0.05)；應激丁酸鈉組與應激生理鹽水組大鼠相比較p-CREB、BDNF 含量均有明顯增加(P<0.01、P<0.05)；對照丁酸鈉組大鼠相對于對照生理鹽水組BDNF 含量有所減少(P<0.05)，而p-CREB 含量則無明顯變化。見表8。

表8　大鼠海馬p-CREB、BDNF 含量

與對照生理鹽水組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與對照丁酸鈉組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3　討　論

本研究采用兩種迷宮來檢測各組大鼠的學習和記憶水平，結果顯示慢性應激能夠在一定程度上損害大鼠的空間識別記憶及空間參考記憶。慢性應激可對大鼠的空間識別記憶造成損傷，這與之前的研究結果一致〔7～10〕。此外，應激強度的改變對空間識別能力亦有影響，在Y 迷宮試驗中，本文說明應激后大鼠的活動性降低，跟造模過程中對應激大鼠的觀察一致。而對體重的分析同樣發現應激造成了大鼠的抑郁樣行為，與眾多的實驗結果相一致〔11〕。在水迷宮定位導航試驗中發現慢性應激在一定程度上損傷了大鼠的空間參考記憶。丁酸鈉屬于非選擇性HDAC抑制劑，可以抑制I 和IIa 型HDAC。本文的研究發現，丁酸鈉可對大鼠空間記憶的損害起保護作用。同樣丁酸鈉對于大鼠的應激后的抑郁樣行為也有輕微改善。正常大鼠腹腔給予丁酸鈉則不會對認知造成影響或造成認知功能的損害。免疫沉淀法研究發現，影響多種基因轉錄的啟動子附近組蛋白乙酰化的部位在H3、H4，所以本文常檢測acH3、acH4 的表達來表示組織乙酰化的水平〔7〕。本研究應激對照說明慢性應激可降低大鼠海馬乙酰化水平，尤其是acH3的乙酰化水平，而丁酸鈉可以逆轉應激大鼠這種乙酰化的降低，尤其是對于H4 的作用更為明顯；但丁酸鈉對正常大鼠海馬中兩種組蛋白的乙酰化水平無顯著作用。最近一項關于HDAC 抑制的研究顯示〔11〕，丁酸鈉作用于離體的大鼠腦片，可顯著增加慢性不可預知應激模型大鼠海馬區域的組蛋白乙酰化水平，尤其是H4 的乙酰化較給予丁酸鈉的正常大鼠的腦片有顯著增加，這與本文的研究結果向一致。對另一種III 型HDAC 抑制劑sirtinol 的研究發現〔12〕，sirtinol 對應激后的大鼠腦片作用明顯，可顯著增加應激大鼠海馬CA3 及DG 組蛋白乙酰化水平，而對于正常大鼠，其對海馬區域乙酰化水平的增加幾乎沒有作用，甚至輕度降低了H3 的磷酸化水平，再次證明丁酸鈉對病理狀態的大鼠與對正常大鼠的作用效果不同。

本研究說明慢性束縛應激顯著降低了海馬p-CREB 的含量，可能通過其對BDNF基因表達的調控，降低應激大鼠海馬中該因子的含量，而丁酸鈉能夠逆轉這種蛋白的降低。結合組蛋白乙酰化的結果推測，丁酸鈉可能是通過調整海馬的乙酰化話水平，增加相應區域p-CREB 的含量，進而影響BDNF 的表達；而丁酸鈉對正常大鼠BDNF的表達有不利影響，這與本文行為學中丁酸鈉降低正常大鼠的認知功能的結果相一致，說明丁酸鈉對認知功能的作用與海馬中BDNF 的含量密切相關，再次證實BDNF 在動物認知功能中的重要作用，與既往的研究結果相吻合〔13〕。綜上研究結果可推測，組蛋白去乙酰化酶丁酸鈉對慢性制動應激大鼠的認知功能具有保護作用，其機制可能是通過恢復慢性激大鼠海馬區域的組蛋白乙酰化水平，進而上調認知相關蛋白如p-CREB、BDNF 的表達來實現，其詳細機制需進一步實驗研究。本文闡明丁酸鈉對慢性應激大鼠認知功能的作用機制，有望對預防及治療慢性應激所致認知損害提供新的理論依據及治療方法。

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〔2016-01-18修回〕

(編輯滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.018

魏艷霞(1975-)，女，碩士，主要從事骨科與神經科康復研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3391-04；