細胞凋亡顯像劑18F-ML-10前體合成及放射性標記

桂　媛，徐志宏, 張曉軍，李云剛，劉　健，張錦明,*

1.華益科技有限公司，江蘇 常熟　215522；2.中國人民解放軍總醫院 核醫學科，北京　100853

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細胞凋亡顯像劑18F-ML-10前體合成及放射性標記

桂媛1，徐志宏1, 張曉軍2，李云剛2，劉健2，張錦明2,*

1.華益科技有限公司，江蘇 常熟215522；2.中國人民解放軍總醫院 核醫學科，北京100853

摘要：18F-2-(5-氟-戊基)-2-甲基丙二酸(18F-ML-10)是一個有潛力的細胞凋亡顯像劑。以5-溴-1-戊醇為原料，合成了前體：5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，采用國產MF-2V-IT-1模塊，經親核取代及堿水解，合成了18F-ML-10；粗產品經HPLC純化及固相萃取，得到18F-ML-10注射液。18F-ML-10的合成效率為(25.3±4.7)%(n=16, 不校正)，產品的放射化學純度大于99%，比活度為740 PBq/mol，K2.2.2含量低于10 mg/L，有機溶劑乙腈殘留量為(0.015±0.01)%(質量分數)，無菌、無熱原符合要求，產品滿足臨床研究需求。

關鍵詞：18F；放射性合成；放射藥物；細胞凋亡；PET

腫瘤細胞凋亡顯像是早期評價腫瘤放化療療效的方法之一, 影像學評價細胞凋亡的方法很多, 但特異性方法較少。第一個特異性腫瘤細胞凋亡顯像劑是99Tcm標記的Annexin V，臨床研究表明：腫瘤攝取99Tcm-Annexin V與其凋亡正相關[1-2]。18F-ML-10(2-(5-fluoro-pentyl)-2-methyl malonic acid)是近年來第一個應用于臨床研究的凋亡顯像的正電子藥物, 用于腦膠質瘤放療后療效早期評價, 臨床初步驗證：膠質瘤經放療后24 h，腫瘤攝取18F-ML-10與治療后8周的核磁共振成像(MR)圖像改變正相關，說明18F-ML-10是一個有潛在臨床價值的細胞凋亡顯像劑[3-5]。Sobrio等[6]報導了以丙二酸二叔丁基酯為起始原料，合成18F-ML-10的前體：5-對甲苯磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二叔丁基酯；該前體的保護基團為叔丁基酯，脫保護需用強酸。Dewkar等[7]報導了以2-甲基丙二酸二乙酯為起始原料，合成了另一個前體：5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，該前體的保護基團為乙酯，較容易脫保護。本研究在文獻[6—7]的基礎上改變原料，合成較容易脫保護的前體：5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，采用國產氟多功能模塊合成18F-ML-10,并進行質量控制，以便將18F-ML-10應用于臨床研究。

1　試劑和儀器

甲苯磺酸吡啶鹽、5-溴-1-戊醇、碘化鉀(KI)、 對甲苯磺酸吡啶鹽、 3,4-二氫吡喃、甲基丙二酸二乙酯、 氫化鈉、二甲基甲酰胺(DMF)、對甲苯磺酰氯，均為分析純，購自阿拉丁試劑；K2.2.2、氧-18水(豐度大于97%)，江蘇華益科技有限公司；SEP-PAK QMA，美國Waters公司；無水乙腈，美國Aldrich公司。

Agilent 6120型質譜儀，美國安捷倫公司；Bruker 300M核磁共振儀，美國布魯克公司；SGWX-4熔點儀，上海精密儀器廠；Sumitomo HM-20S 回旋加速器，日本住友公司；MF-2V-IT-1型氟多功能合成儀，派特(北京)科技有限公司；高效HPLC分析儀，美國Waters公司，配有515泵、2487紫外分析儀、BioScan流動放射性檢測器；GC7890型氣相色譜，上海天美公司。上海三愛思精密試紙(pH=5.5～9.0)。

2　實驗方法

18F-ML-10前體及ML-10標準品合成路線示于圖1。

2.15-溴-1-戊-1-二氫吡喃醚(1)的合成

氮氣保護下，在500 mL三頸瓶中加入4 g對甲苯磺酸吡啶鹽(PPTS，16 mmol)、13.36 g 5-溴-1-戊醇(80 mmol)和200 mL二氯甲烷，滴加10.08 g 3,4-二氫吡喃(120 mmol)的200 mL二氯甲烷的溶液。滴完后，室溫下反應過夜。停止反應，用水洗滌，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾得粗品m=25 g，粗品過300～400目的硅膠柱分離(V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)從5∶1到2∶1梯度洗脫)。

圖1　18F-ML-10前體及ML-10標準品合成路線Fig.1　Reaction scheme for precursor of 18F-ML-10 and ML-10 reference standards

2.25-二氫吡喃醚-戊基-2-甲基丙二酸二乙酯(2)的合成

裝置氮氣保護，加入7 g甲基丙二酸二乙酯(40 mmol)，50 mL無水DMF，冷至0 ℃，分批加入1.5 g 氫化鈉(質量分數80%，48 mmol)，加完后在0 ℃反應0.5 h； 0 ℃下，加入0.6 g KI(3.6 mmol)，后滴加10 g 物質1(40 mmol)的50 mL無水DMF的溶液，加完后升至50 ℃反應過夜。加入飽和氯化銨溶液，調節pH值至中性，加入乙酸乙酯萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，干燥，產品2可直接進行下一步反應。

2.35-戊醇-2-甲基丙二酸二乙酯(3)的合成

500 mL單頸瓶中依次加入13.7 g 物質2、1.6 g PPTS(6.4 mmol)、180 mL乙醇，在55 ℃下回流反應2 h。停止反應，旋干溶劑，柱分離可得產品(柱分離洗脫劑V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=2∶1)。

2.45-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯(4)的合成

裝置氮氣保護，依次加入10 g 物質3、5.76 g 三乙胺(57 mmol)和100 mL二氯甲烷，冷至0 ℃，滴加10.86 g對甲苯磺酰氯(57 mmol)溶于100 mL二氯甲烷的溶液，約1 h滴完，滴完后室溫下反應過夜。停止反應，反應液用飽和食鹽水洗滌后，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋干得粗品，粗品柱分離可得產品(柱分離洗脫劑V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=4∶1)，產物為無色透明液體，純度大于98%。

2.52-(5-氟-戊基)-2-甲基丙二酸(標準品)的合成

裝置氮氣保護，250 mL三頸瓶中依次加入5 g物質4、100 mL乙腈和3.9 g無水四丁基氟化銨(TBAF，15 mmol)，回流反應2 h。停止反應，減壓旋去溶劑，加入約100 mL二氯甲烷然后用2×30 mL水洗滌。有機相干燥，過濾，旋干得粗品。粗品過柱分離可得純品5-氟-2-甲基丙二酸二乙酯(ML-6)(柱分離洗脫劑V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=10∶1)。

100 mL反應瓶中依次加入0.5 g ML-6(1.9 mmol)、0.76 g氫氧化鈉(19 mmol)和20 mL乙醇回流反應約2 h，停止反應，用鹽酸調節pH值至強酸性，過濾，濾餅用少量乙醇洗滌，濾液旋干，殘渣加約10 mL乙酸乙酯，過濾掉不溶性的無機鹽，濾液再次旋干得粗品，粗品用正己烷和乙酸乙酯重結晶可得產品。

2.618F-ML-10的自動化合成

由Sumitomo HM-20S 回旋加速器20 MeV質子轟擊豐度為98%的氧-18水，經18O(p,n)18F反應生成18F離子，將18F離子傳到QMA柱，以下由MF-2V-IT-1型氟多功能合成器自動化合成。依序將安裝在合成器的液體加入，加入1號瓶液體(1 mL的乙腈水溶液，含15 mg K2.2.2和 3 mg K2CO3)，將18F(40～60 GBq)從QMA柱上淋洗入反應管，加熱反應管并通入110 mL/min的氮氣，將反應管中溶液蒸發至干；加2號瓶內液體(2 mL乙腈), 重復以上步驟，將反應管中溶液蒸發至干；加入3號瓶液體(1 mL乙腈溶解10 mg的5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯)，83 ℃加熱反應管5 min ；加入4號瓶液體(0.6 mL 2 mol/L NaOH)115 ℃加熱反應管水解10 min，加入5號瓶液體(4 mL 1 mol/L HCl)中和, 最后加入6號瓶液體(2 mL含1%三氟乙酸(TFA)的20%(體積分數，下同)乙腈)。最終約4 mL的反應液自動移到半制備HPLC上分離，半制備分離柱為：Grace Attach C-18 柱(250 mm×10 mm)，流動相為含1%TFA的20%乙腈，流速為12 mL/min。收集9～10 min的放射性峰，經合成器上固相萃取系統，將含20%乙腈的溶液轉化成含8%乙醇的注射液。

2.718F-ML-10的質量控制

18F-ML-10應為無色透明的溶液，用精密pH試紙測其pH應在6.0～7.0。

取10 μL的18F-ML-10注射液，于美國Waters公司的高效HPLC分析儀上分析，HPLC分析柱為反相C-18柱(Nova ParK C-18，150 mm×3.9 mm)，流動相為含1%TFA的20%乙腈，流速為1 mL/min。氟離子的tR=1.9 min,18F-ML-10的tR=5.8 min，產品的放化純應大于95%。產品與ML-10標準品共注射進樣(1 g/L),紫外波長為254 nm,18F-ML-10放射性峰應與ML-10的紫外吸收峰一致。

取衰變后的18F-ML-10注射液與等體積的標準K2.2.2(100 mg/L)溶液混合，取3 μL點樣于經氯鉑酸和碘化鉀染色的TLC硅膠板上得到A點，同時另取3 μL標準K2.2.2(50 mg/L)、標準K2.2.2(10 mg/L)溶液點樣硅膠板上得到B點、C點, 取3 μL衰變后的18F-ML-10注射液點樣于硅膠板上得到D點。硅膠板上的A點和B點的深藍色斑塊應一致，同時D點的藍色斑塊應小于B點[8]。

取已完全衰變的5 μL18F-ML-10注射液，按文獻[8]方法測殘留乙腈的含量，乙腈含量應不高于0.04%(質量分數)。

按中國藥典 2015 年版二部附錄Ⅺ E和H檢查注射液的內毒素和無菌性，應符合要求。

3　結果與討論

3.1ML-10標準品和前體合成與表征

本研究以5-溴-1-戊醇為原料，最終合成了ML-10標準品和前體。

其中化合物1:純品m=13.7 g，合成產率68%； LC-MS[M+1]+=251(100%),253(97%)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ=4.55～4.60(m,1H)，3.81～3.92(m,1H)，3.69～3.80(dt,1H,J=6.4 Hz、9.7 Hz)，3.46～3.55(m，1H)，3.35～3.45(dt,1H,J=6.4 Hz、9.7 Hz)，3.39～3.45(t,2H,J=6.8 Hz)，1.86～1.97(m,2H)，1.46～1.85(m,10H)。化合物2:粗產品m=2.3 g，產率72.8%, LC-MS：[M+1]+=345，由于直接用于下步反應，沒有做核磁鑒定。化合物3:m=6.4 g，化合物2和3兩步總產率61.5%； LC-MS：[M+1]+=261；1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ=4.12～4.23(q,4H,J=7.3 Hz)，3.56～3.69(t，2H，J=6.1 Hz)，1.76～1.92(m,2H)，1.46～1.65(m,3H)，1.32～1.46(m,2H)，1.40(s,3H)，1.17～1.31(m,2H)，1.21～1.27(t,6H,J=7.3 Hz)。化合物4:m=12.4 g，合成收率78.9%；LC-MS:[M+1]+=339；1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ=4.12～4.26(m,6H)，3.00(s,3H)，1.81～1.90(m,2H)，1.69～1.80(m,2H)，1.36～1.49(m，2H),1.40(s,3H)，1.20～1.35(m,2H)，1.20～1.28(t，6H)。化合物5：m=250 mg，合成收率47%；LC-MS：[M+1]+=415；1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ=7.74～7.82(d，2H，J=8.3 Hz)，7.29～7.39(d,2H,J=8.3 Hz)，4.11～4.21(q,4H,J=7.1 Hz)，3.96～4.04(t,2H,J=6.3 Hz)，2.45(s,3H)，1.74～1.84(m,2H)，1.61～1.70(m,2H)，1.36(s,3H)，1.19～1.27(t,6H,J=7.1 Hz)，1.12～1.38(m,4H)。化合物6：LC-MS：[M+1]+=207；1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ=4.31～4.56(dt,2H,J=6.0、47.4 Hz)，1.86～1.98(m,2H)，1.61～1.82(m,2H)，1.50(s,3H)，1.29～1.55(m,4H)。

Sobrio等[6]采用丙二酸二叔丁基酯與5-溴戊芐醚反應，再經甲基化后，在鈀碳催化下還原芐醚生成5-羥基-戊基-2-甲基丙二酸二叔丁基酯，合成步驟多，所用催化劑價格貴[6]。Dewkar等[7]采用2-甲基丙二酸二乙酯與1,5-二溴戊烷直接反應，生成5-溴-戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，經甲基磺酸銀將其轉化成5-羥基-戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，同樣使用了貴金屬試劑。本研究綜合了二種方面的特點，用3,4-二氫吡喃替代芐基保護，用PPTS可以較容易脫保護，降低了合成成本。本研究從原料到前體共4步，合成總收率為33.4%,高于文獻[6]的28%。

3.218F-ML-10的自動化合成結果

采用MF-2V-IT-1型多功能模塊，單個反應管即能全自動合成18F-ML-10，并完成半制備HPLC的分離和HPLC流動相的溶劑轉換得到注射液。 圖2為半制備HPLC的放射性色譜圖，僅見二個峰，一個是未反應的氟離子峰，另一個即為產品18F-ML-10的峰，說明本反應較單一，沒有其它副反應。從氟離子到產品18F-ML-10花費時間40 min, 合成效率為(25.3±4.7)%(n=16，未衰減校正)，衰減校正后的合成效率為32.6%，該效率低于文獻[6]的39.8%。但文獻[6]為小劑量合成，起始18F量為35～70 MBq，低于本研究18F量三個數量級，本研究的產品活度為10～15 GBq，滿足臨床使用要求。

圖2　半制備HPLC的18F-ML-10放射性色譜圖Fig.2　Semipreparative radioactive HPLC traces for 18F-ML-10

3.318F-ML-10的質量控制結果

經溶劑轉換后的含w=8%乙醇的18F-ML-10注射液為無色透明的液體，溶液pH=6.5。

產品的活度為10～15 GBq，活度濃度為1.0～1.5 TBq/L。

完全衰變后的18F-ML-10注射液點樣于硅膠板上得到D點沒有斑點形成，基本無色、無色環，低于標準K2.2.2( 10 mg/L)溶液的色斑C點。符合我國關于18F-FDG注射液中K2.2.2含量低于50 mg/L的要求[9]。

經分析型HPLC分析表明，在HPLC柱上僅一個放射性主峰，該峰的保留時間與ML-10標準品的紫外吸收峰保留時間一致(圖3)，18F-ML-10的放射化學純度大于99%, 比活度為740 PBq/mol。

圖3　18F-ML-10的分析型HPLC放射性(B)和ML-10標準品的紫外色譜圖(A)Fig.3　18F-ML-10 radioactivity(B) and ML-10 UV traces(A)

經GC分析表明，有機溶劑乙腈的殘留為(0.015±0.01)%(質量分數)。

注射液的內毒素和無菌性，符合要求。

4　結　論

本研究以5-溴-1-戊醇為原料，合成了前體5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯和標準品F-ML-10，用3,4-二氫吡喃替代芐基保護，用PPTS可以較容易脫保護，降低了合成成本。同時采用國產氟多功能模塊，自動合成了18F-ML-10，合成效率為(25.3±4.7)%，18F-ML-10放射化學純度大于99%，K2.2.2含量低于10 mg/L，

乙腈含量低于0.04%(質量分數)，產品滿足臨床研究的需求。

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收稿日期：2015-04-21；

修訂日期：2015-11-19

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81371593)

作者簡介：桂媛(1981—)，女，江西九江永修人，博士，高級工程師，從事有機合成工作 *通信聯系人：張錦明(1965—)，男，江蘇南通人，博士，研究員，從事核醫學工作，E-mail: zhangjm301@163.com

中圖分類號：R817

文獻標志碼：A

文章編號：0253-9950(2016)03-0188-05

doi：10.7538/hhx.2016.38.03.0188

Synthesis Precursor of Apoptosis Imaging Agent18F-ML-10 and Its Radiolabing With18F

GUI Yuan1, XU Zhi-hong1, ZHANG Xiao-jun2, LI Yun-gang2, LIU Jian2, ZHANG Jin-ming2,*

1.Huayi Science & Technology Co. Ltd., Changshu 215522, China;2.Department Nuclear Medicine, The PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Abstract:18F-2-(5-fluoro-pentyl)-2-methyl malonic acid(18F-ML-10) is one of the competitive candidate for apoptosis imaging with PET. ML-10 as reference and its OTs derivative (diethyl 2-methyl-2-(5-(tosyloxy)pentyl) malonate) as precursor for labeling with fluorine-18 were prepared.18F-ML-10 was synthesized via nucleophilic substitution and base hydrolysis. The18F-ML-10 injection was got by semi-HPLC and solid-extraction-preparation via home MF-2V-IT-1 module. The synthesis yield of18F-ML-10 is (25.3±4.7)%(n=16, no corrected decay), and the specific activity is 740 PBq/mol. The radiochemical purity is over 99%. The residuary acetonitrile in the injection is (0.015±0.01)%(w). The K2.2.2 mass concentration in the injection is low than 10 mg/L. The injection is free of bacteria and pyrogen. It can be used for clinical research.

Key words:18F; radiosynthesis; radiopharmaceuticals; apoptosis; PET