HHIP基因單核苷酸多態性與新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病易感性的相關性

任俠，關鍵，張中宏，梁文晉，宋麗軍，成芳娟，馬程遠

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832008)

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HHIP基因單核苷酸多態性與新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病易感性的相關性

任俠，關鍵，張中宏，梁文晉，宋麗軍，成芳娟，馬程遠

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832008)

目的 探討人音猬因子相互作用蛋白(HHIP)基因單核苷酸多態性與新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性之間的關系。方法 以233例維吾爾族COPD患者為病例組，292例維吾爾族健康體檢者為對照組，提取外周血標本DNA，運用iMLDR分型技術檢測HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T位點多態性。結果HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T位點在病例組與對照組中的基因型及等位基因頻率分布比較，P均>0.05。兩個位點的4種單體型(AC、AT、GC、GT)在對照組和病例組中的分布比較，P均>0.05。rs13141461C/T基因加性模型(GGvs.AGvs.AA)與第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)有關(P均<0.05)，隱性模型(CC+CTvs.TT)與FEV1占預計值的百分比(FEV1%pred)和FEV1/FVC都有關(P均<0.05)。結論HHIP基因rs13118928A/G可能不是新疆維吾爾族COPD人群易感位點，rs13141461C/T基因加性模型(GGvs.AGvs.AA)與FEV1/FVC有關，隱性模型(CC+CTvs.TT)與FEV1%pred和FEV1/FVC有關。

肺疾病，慢性阻塞性；人音猬因子相互作用蛋白；核苷酸多態性；維吾爾族；新疆

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以不完全可逆性氣流受限為特征的疾病狀態，氣流受限呈進行性，并伴有肺對毒性顆粒或氣體的異常炎癥反應，是一種復雜的多因素疾病[1]，可能受環境和基因突變因素影響。目前COPD的發病機制仍未完全闡明。Hh信號通路在細胞生長分化、血管重建、胚胎發育中起重要作用。人音猬因子相互作用蛋白(HHIP)基因位于染色體4q31.21～31.3，參與維持正常肺功能及肺泡結構，作用于人肺上皮細胞的Hh通路，使其出現功能障礙，并導致肺發育畸形，在發育成熟肺中可促進肺纖維化[2,3]。研究顯示，HHIP基因多態性與COPD易感性存在種族差異，該基因是否與新疆維吾爾族人群COPD易感性相關尚不清楚。本研究旨在探討新疆維吾爾族人群HHIP rs13118928、rs13141461基因多態性與COPD易感性的相關性，從分子水平研究新疆地區維吾爾族人群COPD病程進展中遺傳因素的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年10月～2016年8月本院診斷為COPD的維吾爾族患者233例(病例組)，男145例、女88例，年齡(63.30±10.67)歲，同期在體檢中心進行健康體檢的維吾爾族健康人292例作為對照組，其中男168例、女124例，年齡(61.68±9.55)歲。納入標準：吸入支氣管舒張劑后第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)<70%，FEV1占預計值的百分比(FEV1%pred)>80%。排除合并肺癌、支氣管哮喘、其他慢性呼吸系統疾病等影響肺功能測定結果的疾病。

1.2 方法

1.2.1 HHIP基因組DNA提取 清晨采集入選對象肘正中靜脈血2 mL，EDTA管抗凝混勻，嚴格按照由北京TIANGEN公司提供的離心柱型試劑盒說明書提取DNA，采用NanoDrop-2000核酸蛋白測序儀檢測DNA濃度及純度，-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 HHIP基因多態性檢測 ①引物設計與合成:根據GenBank提供基因序列，運用Primer4.0軟件對引物進行設計，可得到用于特異性擴增的PCR上、下游引物和延伸引物，引物合成與設計均由上海天昊生物科技有限公司完成。其中rs13118928A/G：上游引物：5′-TTTCTGAGCAGGGAGGGCATCT-3′，下游引物：5′-GGAATTTCTCACAGTGCACACAGG-3′，擴增長度299 bp；rs13141461C/T：上游引物：5′-GGTGTGTCCTGCCAATCCAAAG-3′，下游引物：5′-TCTCCACCCCAACCAATTAGCA-3′，擴增長度285 bp。②PCR反應：PCR擴增：PCR反應體系(10 μL)包含1×GC-Ⅰ buffer(Takara), 3.0 mmol/L Mg2+, 0.3 mmol/L dNTP, HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc)1 U，樣本DNA 1 μL和多重PCR引物1 μL。PCR反應條件：95 ℃ 預變性2 min；94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min,11個循環變性，每個循環溫度降低0.5 ℃；94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min,24個循環退火；72 ℃延伸2 min；反應結束，4 ℃保存。PCR反應產物純化：在剩余的PCR反應體系中加入蝦堿酶5 U和外切核酸酶2 U，37 ℃溫浴1 h, 然后75 ℃滅活15 min。連接反應：反應體系包括10×連接緩沖液1 μL、高溫連接酶0.25 L、5′連接引物混合液(1 μmol)0.4 μL，3′連接引物混合液(2 μmol) 0.4 μL、純化后多重PCR產物2 L、ddH2O 6 μL 充分混勻。反應條件： 94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min，38個循環，反應結束后4 ℃保存。延伸產物測序：取0.5 μL稀釋后的連接產物，與Liz 500 SIZE STANDARD 0.5 μL，Hi-Di 9 μL混勻，95 ℃變性5 min后通過ABI3730XL測序儀的毛細管電泳來區分，原始數據文件用GeneMapper4.1軟件(Appliedbiosystems)來分析。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。兩組間如符合正態分布采用兩獨立樣本t檢驗，對Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗、基因位點分布頻率及性別進行χ2檢驗，HHIP基因單核苷酸多態性位點與肺功能關系采用回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。通過SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/SHEsis Main.htm)在線軟件完成單體型分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗 rs13118928A/G、rs13141461C/T兩個位點基因型的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P分別為0.079 47、0.053 75)，選取的樣本群體代表性良好。

2.2 兩組基因型以及等位基因頻率分布比較 病例組rs13118928A/G基因型AA、AG、GG分別為67(28.8%)、103(44.2%)、63例(27.0%)，等位基因A、G分別為237(50.9%)、229頻次(49.1%)；對照組分別為94(32.2%)、138(47.3%)、60例(20.5%)，326(55.8%)、258頻次(44.2%)。病例組rs13141461C/T基因型TT、TC、CC分別為82(35.2%)、114(48.9%)、37例(15.9%)，等位基因T、C分別為278(60.0%)、188頻次(40.0%)；對照組分別為90(30.8%)、153(52.4%)、49例(16.8%)，333(57.0%)、251頻次(43.0%)。兩組rs13118928A/G、rs13141461C/T基因型分布、等位基因頻率比較，P均>0.05。

2.3 HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T位點單體型分析 通過SHEsis在線軟件分析得出rs13118928A/G、rs13141461C/T位點多態性共有4種單體型頻率大于1%。對照組單體型AC、AT、GC、GT分別為148.65(0.255)、177.35(0.304)、102.35(0.175)、155.65頻次(0.267)，病例組分別為96.28(0.207)、140.72(0.302)、91.72(0.197)、137.28頻次(0.295)，OR(95%CI)分別為0.763(0.570～1.021)、0.992(0.761～1.293)、1.153(0.844～1.576)、1.149(0.877～1.507)，P分別為0.07、0.95、0.37、0.31。

2.4 HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T基因模型與肺功能的關系 HHIP基因rs13141461C/T單核苷酸多態性加性模型(GG vs. AG vs. AA)與FEV1/FVC有關，隱性模型(CC+CT vs. TT)與FEV1% pred和FEV1/FVC都有關(P均<0.05)，rs13118928A/G與肺功能無關(P均﹥0.05)。

3 討論

通常情況下，Hh信號通路在機體發育成熟后進入失活狀態。在哺乳動物體內，Hh信號通路主要由配體(SHh、IHh、DHh)、膜受體PTCH (PTCH1、PTCH2)和SMO、轉錄因子Gli(Gli1、Gli2)、Fu抑制劑(SuFu)組成[4,5]。其中PTCH為12次跨膜蛋白，是Hh信號通路的主要受體[6]。PTCH能夠通過調控小分子化合物運輸間接地調控7次跨膜受體SMO的活性[7]；SMO負責細胞內信號，通過一系列復雜蛋白復合物的作用調控核轉錄因子Gli的數量及活性，接著Gli家族將信號傳導至細胞核。當配體Hh不存在時，膜受體PTCH抑制SMO受體上膜，從而抑制下游通路，導致Hh通路受到抑制。當配體Hh與PTCH結合后，解除PTCH對SMO的抑制作用，使得全長Gli蛋白進入核內激活下游靶基因轉錄，激活Hh靶基因。HHIP基因編碼的糖蛋白能與PTCH競爭性地結合Hh配體，使配體Hh喪失激活Hh信號通路的功能。Hh信號通路異常激活可以引起哮喘、肺癌、COPD發生和發展。

目前HHIP基因已經成為研究熱點。Kim等[1]研究發現，HHIP基因rs13118928A/G G等位基因可以降低COPD發病風險。全基因組關聯研究發現，rs13118928A/G位點與COPD肺功能FEV1%pred有關。但在國際COPD遺傳網絡研究高加索人、中國漢族、中國黎族中并未發現此位點與FEV1%pred有關。由于目前HHIP基因位點與COPD之間的關系尚存在爭議，因此有必要在不同民族對此位點與COPD的關系進行探討。

本研究顯示，HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T位點的基因型及等位基因頻率分布在病例組與對照組間比較差異無統計學意義，因此推測兩位點與新疆維吾爾族COPD易感性可能無關。單體型分析結果顯示，AC、AT、GC、GT 4種單體型在病例組和對照組中分布無統計學意義。肺功能結果提示rs13141461C/T單核苷酸多態性基因加性模型(GG vs. AG vs. AA)與FEV1/FVC有關，隱性模型(CC+CTvs.TT)與FEV1%pred和FEV1/FVC有關。本研究與其他研究結果存在差異，可能原因：①COPD發病原因復雜，此次研究無法進行基因-基因、基因-環境間的交互作用分析；②新疆地域廣，維吾爾族屬于少數民族，樣本收集過程較難，造成此次樣本收集偏少，可能會對結果造成一定影響；③HHIP基因位點較多，各位點之間存在連鎖不平衡，不能明確起決定性的基因位點。今后有必要進行大樣本、多民族、多地區的病例對照研究，構建完整的信息資料庫，進一步揭示HHIP基因多態性與COPD易感性的關系。

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Association between single nucleotide polymorphism of HHIP gene and susceptibility to COPD in Uygur patients

RENXia,GUANJian,ZHANGZhonghong,LIANGWenjin,SONGLijun,CHENGFangjuan,MAChengyuan

(TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziMedicalUniversity,Shihezi832008,China)

Objective To investigate the relationship between single nucleotide polymorphism of human hedgehog-interacting protein (HHIP) gene and susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in Xinjiang Uygur population. Methods We extracted DNA from peripheral blood samples in 233 cases of Uygur patients with COPD (COPD group) and 292 cases of healthy controls (control group), and then detected HHIP gene rs13118928A/G and rs13141461C/T polymorphism loci by iMLDR technique.Results Alleles and genotype frequency distribution of rs13118928A/G and rs13141461C/T in HHIP gene between the COPD group and control group showed no significant difference, allP>0.05. Meanwhile, no significant difference was found in the 4 haplotypes (AC, AT, GC and GT) of rs13118928A/G and rs13141461C/T between the COPD group and control group, allP>0.05. Rs13141461C/T gene log-model (GG vs. AG vs. AA) was related with FEV1/FVC (P<0.05), and the recessive model (CC+CT vs. TT) was related with both FEV1% predicted value (FEV1%pred) and FEV1/FVC (allP<0.05).Conclusions The polymorphism loci of rs13118928A/G may be not the susceptibility gene of COPD in Xinjiang Uygur population. The rs13141461C/T gene log-model (GG vs. AG vs. AA) is related with FEV1/FVC, and the recessive model (CC+CT vs. TT) is related with FEV1%pred and FEV1/FVC.

pulmonary disease, chronic obstructive; human hedgehog-interacting protein gene; single nucleotide polymorphism; Uygur nationality; Xinjiang

國家自然科學基金資助項目(81560009)；石河子大學醫學院第一附屬醫院科研項目(BS2016090)。

任俠(1989-)，女，碩士研究生，主要研究方向為呼吸系統疾病的基礎研究。E-mail: 244355830@qq.com

關鍵(1968-)，男，博士，主要研究方向為呼吸系統疾病的基礎及臨床研究。E-mail: guanjian6@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.004

R563.13

A

1002-266X(2016)45-0012-03

2016-08-29)