納洛酮對油酸型ARDS大鼠血清中心房鈉尿肽、B型腦鈉肽及肺組織Na+-K+-ATP酶含量的影響研究

崔青松　金明根　黃莉花延邊大學附屬醫院重癥醫學科，吉林延吉　133000

納洛酮對油酸型ARDS大鼠血清中心房鈉尿肽、B型腦鈉肽及肺組織Na+-K+-ATP酶含量的影響研究

崔青松金明根黃莉花
延邊大學附屬醫院重癥醫學科，吉林延吉133000

目的研究納洛酮對油酸型急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）大鼠的血清中心房鈉尿肽、B型腦鈉肽及肺組織Na+-K+-ATP酶含量的影響。方法2014年1月～2015年1月將30只健康SD大鼠隨機分為正常組、ARDS模型組、納洛酮治療組，由股靜脈緩慢注入油酸0.1mL/kg建立ARDS模型，測定血清中心房鈉尿肽（ANP）、B型腦鈉肽（BNP）、肺組織Na+-K+-ATP酶（NKA）含量，計算左肺濕/干重比值，制備光鏡標本和電鏡標本觀察肺組織。結果ARDS模型組與正常組比較，左肺濕/干重比值、血清ANP、BNP含量顯著升高，肺組織NKA含量顯著下降（P＜0.01），肺組織出現明顯病理損害，與ARDS模型組比較納洛酮治療組的變化較輕（P＜0.01），肺組織變化較輕。結論納洛酮可抑ANP、BNP升高，提高肺組織Na+-K+-ATP酶活性，納洛酮對實驗性大鼠油酸型急性呼吸窘迫綜合征有一定的治療作用。

納洛酮；急性呼吸窘迫綜合征；油酸；心房鈉尿肽；B型腦鈉肽

［Abstract］Objective To study the influence of naloxone on serum atrial natriuretic peptide（ANP）and B-type natriuretic peptide（BNP），and Na+-K+-ATP enzyme（NKA）content in lung tissues in oleic acid induced acute respiratory distress syndrome（ARDS）rats.M ethods From January 2014 to January 2015，30 healthy SD ratswere randomly divided into normal group，ARDSmodel group，and naloxone treatment group.The ARDSmodel was established by oleic acid 0.1 mL/kg i.v.，and levels of serum ANP and BNP，and NKA content in lung tissues were determined.The wet/dry weight ratio of the left lungwas calculated，and the lung tissueswere observed by lightmicroscope and electronmicroscope.Results The wet/dry weight ratio of the left lung，and levels of serum ANP and BNPwere significantly higher in the ARDSmodel group than in the normal group，and the NKA content in lung tissues was significantly lower in the ARDSmodel group than in the normal group（P＜0.01），with evident pathological impairment of lung tissues.While compared with the ARDSmodel group，the pathological change in the naloxone treatment group wasmilder（P＜0.01），with less pathological impairment of lung tissues.Conclusion Naloxone can inhibit the increase of ANP and BNP，and enhance the enzymatic activity of Na+-K+-ATP enzyme in lung tissues，thus showing a certain therapeutic effect on experimental ratswith oleic acid induced acute respiratory distress syndrome.

［Key words］Naloxone；Acute respiratory distress syndrome；Oleic acid；Atrial natriuretic peptide；B-type natriuretic peptide

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是重癥醫學科的常見病、多發病，是指由心源性以外的各種肺內外致病因素所導致的以進行性低氧血癥、呼吸窘迫為特征的臨床綜合征［1，2］。雖然目前ARDS的治療手段有所改善，但是其發病機制仍不清楚，患者的病死率仍較高［3］。ARDS的發病機制錯綜復雜，近年來有資料表明鈉水轉運與ARDS的發病有關。ANP與BNP均為鈉尿肽家族的一員，肺是右心房釋放ANP后的第一個靶器官，所以ANP可對肺循環和肺通氣功能具有調節作用，BNP主要代謝場所是肺循環，ARDS時嚴重損傷肺毛細血管網，使肺臟對BNP清除能力進而下降［4］。本實驗旨在觀察ARDS大鼠血清中心房鈉尿肽（ANP）、B型腦鈉肽（BNP）含量、肺組織Na+-K+-ATP酶（NKA）活性的變化，納洛酮對ARDS的抑制作用及其作用機制，為ARDS的臨床防治提供思路，現將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

油酸（沈陽市東興試劑廠），鹽酸納洛酮注射液（北京凱因科技股份有限公司），ANP酶鏈免疫吸附（ELISA）試劑盒（加拿大HCB公司產品），BNP酶鏈免疫吸附（ELISA）試劑盒（加拿大HCB公司產品），NKA測試盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.2動物及分組

2014年1月～2015年1月選取SD大鼠30只，雌雄不拘，體質量（200±20）g，由延邊大學實驗動物中心提供［許可證號SCXK（吉）2011-0007］，將大鼠隨機分為正常組、ARDS模型組、納洛酮治療組各10只。由大鼠左下腹注入20%烏拉坦1.0 g/kg正腹腔麻醉，剝離股動脈和股靜脈，并將自制靜脈管插入股靜脈。正常組：向股靜脈緩慢注入0.9%生理鹽水4.1 mL/kg。ARDS模型組：先注入油酸0.1mL/kg及0.9%生理鹽水4.0mL/kg。納洛酮治療組：建立模型，隨即注入納洛酮注射液1.0mg/kg及0.9%生理鹽水2.0mL/kg。

1.3生物材料的制備

給藥后3 h，腹主動脈采血，離心分離血清，-40℃凍存，待測ANP、BNP。腹主動脈采血后處死大鼠，取左肺稱取濕重，置于68℃恒溫箱48 h完全脫水后稱取干重，計算左肺濕/干重比值。取右肺上葉，制作成蠟塊，行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變；取右肺下葉混合樹脂包埋，行雙重染色，電鏡下觀察肺組織病理改變。取右肺中葉制備成組織勻漿，取上清液，凍存，待測NKA活性、組織總蛋白。

1.4生物化學指標檢測

血清ANP、BNP及肺組織NKA活性檢測均嚴格按照說明書進行操作并計算。

1.5統計學分析

采用SPSS17.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，行方差分析和t檢驗；左肺濕/干重比值與相關指標的關系采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1三組大鼠左肺濕/干重比值、血清中ANP、BNP含量比較

ARDS模型組、納洛酮治療組大鼠左肺濕/干重比值、血清中ANP、BNP含量與正常組比較均明顯升高（P＜0.01），而納洛酮治療組與ARDS模型組比較下降（P＜0.01），ARDS模型組、納洛酮治療組肺組織Na+-K+-ATP活性與正常組比較均明顯下降（P＜0.01），而納洛酮治療組與ARDS模型組比較明顯升高（P＜0.01）。見表1。

表1　三組左肺濕/干重比值、肺組織Na+-K+-ATPase活性、血清中ANP、BNP含量變化比較（±s）

表1　三組左肺濕/干重比值、肺組織Na+-K+-ATPase活性、血清中ANP、BNP含量變化比較（±s）

注：左肺濕/干重比：模型組與正常組比較：t=2.31，▲P＜0.05；治療組與正常組比較：t=2.28，▲P＜0.05；治療組與模型組比較：t=2.87，★P＜0.05；Na+-K+-ATPase活性：模型組與正常組比較：t=2.98，▲P＜0.05；治療組與正常組比較：t=2.54，▲P＜0.05；治療組與模型組比較：t=3.98，★P＜0.05；ANP：模型組與正常組比較：t=20.54，▲P＜0.05；治療組與正常組比較：t= 28.71，▲P＜0.05；治療組與模型組比較：t=24.36，★P＜0.05；BNP：模型組與正常組比較：t=37.26，▲P＜0.05；治療組與正常組比較：t=31.65，▲P＜0.05；治療組與模型組比較：t=29.48，★P＜0.05

組別n左肺濕/干重比Na+-K+-ATPase活性［（μmolpi/ （mgprot·hour）］ANP（pg/mL）BNP（pg/mL）正常組10模型組10治療組F值P 4.23±0.12 5.95±0.11▲5.17±0.72▲★11.81 ＜0.01 3.84±0.99 2.77±0.79▲3.12±0.81▲★8.97 ＜0.01 116.02±3.32 284.49±26.05▲167.61±16.54▲★25.93 ＜0.01 74.88±6.54 183.13±9.73▲115.76±7.07▲★34.28 ＜0.01

2.2肺組織Na+-K+-ATPase活性、血清ANP、BNP與左肺濕/干重比值相關分析

相關系數r分別為-0.901、0.945、0.935，P值分別為0.001、0.001、0.001（P＜0.01）。

2.3病理學觀察結果

2.3.1肺組織病理切片光鏡下觀察ARDS模型組，可見肺間質和肺泡內水腫，灶性或大片的肺泡萎縮，大量中性粒細胞浸潤，部分可見透明膜形成；納洛酮治療組上述表現較輕，未見透明膜形成，正常組無上述改變。見封三圖1～4。

2.3.2肺組織病理切片電鏡下觀察ARDS模型組Ⅰ型肺泡上皮細胞及內皮細胞腫脹和壞死，Ⅱ型肺泡上皮細胞板層小體變性、破壞、排空現象，見大小不均的空泡，肺泡間隔增寬，納洛酮治療組上述變化較輕。見封三圖5～7。

3　討論

Na+-K+-ATP酶（NKA），又稱鈉泵，即鈉-鉀泵，簡稱鈉泵，是在哺乳動物的細胞膜上普遍存在的離子泵，廣泛存在于各種細胞的細胞膜上，細胞代謝能量的1/3以上用于鈉泵的運轉，具有重要的生理意義。通過研究發現，NKA的活性在活體細胞的總活性中只占其1/3，其活性可能是因為氧化應激、缺O2、心房尿鈉肽、麻醉所損害［5，6］。ARDS時因為肺泡上皮細胞膜上的NKA活性下降，造成肺組織清除液體能力下降［7］。ARDS是以損害毛細血管內皮細胞及肺泡上皮細胞，使其增加肺通透性，肺間質及肺泡水腫為病理基礎，而機體內有效的氣體交換過程中，維持肺泡內相對干燥環境，肺組織主動轉運系統中的NKA起著重要作用。本實驗結果表明，油酸所致ARDS大鼠模型中NKA活性下降，與左肺濕/干重比值呈負相關，提示NKA可作為觀察ARDS動物模型疾病輕重指標，且在肺水腫形成過程中起重要作用。

1981年De-Bole等［8］首次發現ANP，心房鈉尿肽（ANP）主要由心房肌細胞分泌，具有強大的利鈉利尿作用，是參與體內體液調解的重要激素之一。右心房釋放心房鈉尿肽后的第一個靶器官和清除場地是肺，因此ANP對肺通氣功能與肺循環起關鍵調節作用。ANP在呼吸系統疾病中主要起到的作用為擴張支氣管、降低肺動脈高壓、調節通透性、抑制炎癥細胞因子分泌等［9，10］。本實驗結果表明，油酸所致ARDS大鼠模型中ANP水平明顯升高，與正常組比較差異有顯著性，ANP與左肺濕/干重比值呈正相關，以上表明ANP可能間接反映肺水腫及肺損傷嚴重程度。

BNP屬于利鈉肽家族成員之一，具有強大的利鈉、利尿以及血管擴張的作用。BNP主要在肺循環中代謝，ARDS時肺毛細血管網受損傷，肺對BNP消滅能力降低。研究還顯示炎癥因子（主要是IL-1β、IL-6、TNF-α）釋放、交感神經系統興奮促使BNP釋放。正常肺由肺泡上皮和肺微血管內皮細胞構成良好的肺泡-毛細血管屏障。ARDS顯著的組織學特征就是肺微血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，肺血管通透性增加，這種肺毛細血管網嚴重破壞，對BNP的降解清除能力下降。ARDS存在肺內微循環障礙，引起肺循環高凝狀態，肺內微血栓形成，肺動脈壓升高，致右心負荷過重，導致血漿BNP的升高［11-13］。本實驗結果表明，油酸所致ARDS動物模型中BNP水平明顯升高，與正常組比較差異有顯著性，BNP與左肺濕/干重比值呈正相關，以上表明BNP是ARDS發病機制中產生肺水腫的因素之一。

納洛酮為內源、非特異性阿片受體阻斷劑，脂溶性高，并迅速分布全身，尤以腦、肺、腎和心臟中濃度較高。本實驗結果表明納洛酮治療組大鼠左肺W/D、血清ANP、BNP含量一定程度降低，Na+-K+-ATP酶活性升高與ARDS模型組比較差異有顯著性。光鏡及電鏡病理改變較ARDS模型組輕，表明納洛酮對油酸型ARDS大鼠有一定的治療作用。這可能與納洛酮穩定溶酶體膜、保護細胞功能、改善微循環、降低內皮素和腫瘤壞死因子水平等作用［14，15］；恢復NKA功能，減少肺水腫，減少ANP和BNP在肺部釋放，從而程度不等的降低肺水腫及肺動脈高壓的發生率等有關。

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Influence of nnaloxone on serum atrial natriuretic peptide and B-type natriuretic peptide，and Na+-K+-ATP enzyme content in lung tissue in oleic acid induced ARDS rats

CUI Qingsong JIN Minggen HUANG Lihua
ICU，Yanbian University Affiliated Hospital，Yanji133000，China

R563.8

A

1673-9701（2016）15-0023-03

2016-03-28）