荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A多態性與體細胞評分的相關分析

李強子，劉麗霞，岳炳輝2，張 麗，*（.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；2.青海畜牧獸醫職業技術學院，青海湟源8200）

荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A多態性與體細胞評分的相關分析

李強子1，劉麗霞1，岳炳輝2，張 麗1，*
（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；2.青海畜牧獸醫職業技術學院，青海湟源812100）

為尋找與乳房炎相關的分子標記，以期為荷斯坦牛的抗病育種提供理論基礎，利用PCR-SSCP技術和直接測序技術對寧夏農墾303頭中國荷斯坦牛的TLR6基因進行了遺傳多態性分析，利用一般線性模型分析TLR6基因c.640G＞A突變位點與中國荷斯坦牛體細胞評分（SCS）以及各個因素之間的相關性。結果表明，中國荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A突變位點與SCS值和胎次之間存在極顯著和顯著相關性，GA和AA基因型個體的SCS值極顯著低于GG基因型個體（P＜0.01）。因此，在中國荷斯坦牛育種中，可嘗試將c.640G＞A突變位點的GA基因型作為低SCC/SCS牛的優良基因型加以應用。

荷斯坦牛；TLR6基因；c.640G＞A；體細胞評分

乳腺炎在泌乳牛群體中發病率極高。導致奶牛乳房炎發生的因素很多，遺傳因素是主要因素之一。隨著分子生物學的深入研究，利用分子標記技術進行的遺傳多態性研究得到了較為廣泛的應用。Toll樣受體6（Toll-like receptor 6，TLR6）作為一類模式識別受體，能在抗原入侵機體早期激活免疫細胞，并與TLR2聚合形成異嗜二聚體結構而增強TLR2對某些抗原的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的識別［1］，進而防止奶牛乳房炎的發生。研究發現，TLR6基因被定位于牛的第6號染色體上［2］。Axford等［3］發現鼠的TLR6基因主要表達在脾等胸腺免疫器官中。林寶山等［4］研究表明，牦牛TLR6基因在所有組織均有表達，而在脾臟中的表達量最高。但國內外關于牛TLR6基因多態性的報道相對較少。Opsal等［5］在挪威紅牛TLR6基因mRNA序列中發現其c.149G＞A 1個突變位點。儲明星等［6］發現中國荷斯坦牛河北群體存在c.638T＞A、c.640G＞A、c.1578G＞A、c.1644C＞A、c.1720G＞A、c.1765A＞G 6個突變位點，并與奶牛乳房炎之間存在相關性。

基于此，本試驗利用PCR-SSCP技術對中國荷斯坦牛寧夏群體的TLR6基因進行多態性分析，并研究變異位點對體細胞評分的遺傳效應，以期尋找對乳房炎抗性有顯著效應的遺傳標記，從而為荷斯坦牛抗病育種和功能基因的分子遺傳相關研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和生產性能測定

血樣采自寧夏賀蘭山奶業有限公司同一奶牛場的303頭泌乳期荷斯坦牛，醫用采血管尾靜脈采血10 mL，-20℃保存。上述荷斯坦牛均是新疆天康集團6頭種公牛后代，胎次為1～5胎，全混合日糧飼喂，每日采食至少3次，有完整系譜和1 a的生產性能測定（DHI）報告。生產性能測定期為產后第6天至干乳前6天，間隔為26～33 d。每頭泌乳牛采樣量為40 mL，按照4∶3∶3（早∶中∶晚）比例進行取樣后送至寧夏DHI中心進行檢測。

1.2 引物設計與PCR-SSCP

采用苯酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取總基因組DNA，去離子水溶解稀釋，-20℃保存備用。

根據GenBank上已公布的荷斯坦牛TLR6基因的mRNA序列（GenBank：NM_001001159），用Primer 5.0軟件設計1對特異性引物用于擴增中國荷斯坦牛寧夏群體的TLR6基因。引物序列為：F，5′-CAACTTGACCCAACTGAAT-3′；R，5′-TTGTAAGCACGCTAAACTA-3′，由大連寶生物公司合成。PCR擴增體系25 μL：基因組DNA模板1.0 μL，上游引物F（0.25 μmol·L-1）0.5 μL，下游引物R（0.25 μmol·L-1）0.5 μL，Taq PCR Master Mix 13.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性4 min；94℃變性30 s，60.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠對其擴增產物進行檢測。

吸取3 μL PCR產物加入至7 μL變性上樣緩沖液（0.025%溴酚藍、98%去離子甲酰胺、10 mmol·L-1EDTA、0.025%二甲苯氰）中，加熱器98℃變性10 min后迅速冰浴10 min。將變性后的PCR產物依次上樣到10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠孔中（Acr∶Scr=39∶1），160 V電壓、電泳槽水循環溫度18℃電泳4 h。電泳結束后利用銀染法染色并判定基因型。

1.3 等位基因序列的回收測定與分析

SSCP圖譜進行分析判型，將每種基因型的5個不同個體的PCR產物用凝膠純化回收試劑盒純化回收后送至北京華大公司進行測序。使用BioEdit和Lasergene軟件分析測序峰圖并判斷突變位點及突變方式。

1.4 一般線性模型構建和統計分析

乳中的體細胞數（somatic cell count，SCC）呈偏離正態性和齊性分布，因而需根據公式體細胞評分（somatic cell score，SCS）=［log2（SCC/ 100）］+3將體細胞數轉化為體細胞評分后進行關聯分析，其中SCC單位為1 000 mL-1［7］。

應用PopGen 32軟件計算各SNP基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量。使用統計軟件包SPSS 19.0中的General Linear Models構建一般線性模型：

上式中，Yijk和Yik為體細胞評分值；μ為群體均值；Ai為第i種基因型固定效應（i=AA、AB、BB）；Bj為第 j個產犢月份固定效應（j=1，2，3，…，n）；Ck為第k個胎次的固定效應；Ai×Ck為基因型與胎次的互作效應；eijk和eik為隨機殘差效應。體細胞評分的分析結果用“均值±標準誤”表示，方差分析結果顯著時應用LSD法進行多重比較。由于用于基因型效應分析的個體均來自于同一飼養場的同一群體，因此，模型中不包含場效應和品種效應。

2 結果與分析

2.1 TLR6基因PCR擴增結果

荷斯坦牛寧夏群體TLR6基因PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠（150 V，15 min）電泳，電泳條帶清晰無雜帶，與預期目的片段長度（241 bp）相符（圖1），可以用于SSCP檢測。

圖1 中國荷斯坦牛TLR6基因PCR擴增產物Fig.1 PCR products of TLR6 gene in Chinese Holstein

圖2 中國荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A不同基因型堿基突變情況Fig.2 TLR6 gene c.640G＞A mutation of different genotypes in Chinese Holstein

圖3 中國荷斯坦牛TLR6基因PCR產物SSCP檢測結果Fig.3 SSCP analysis of PCR amplification of TLR6 gene in Chinese Holstein

圖4 荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A GG/AA基因型編碼蛋白序列Fig.4 Holstein TLR6 gene c.640G＞A GG/AA genotype encoded protein sequence

2.2 PCR-SSCP檢測及序列測定分析

荷斯坦牛寧夏群體TLR6基因PCR擴增產物經SSCP分型后的測序結果與普通牛TLR6基因序列（NM_001001159）對比發現，在c.640G＞A處發現1個突變位點（圖2），在該位點共檢測到2個等位基因G和A，且等位基因G和A均具有純合型個體，共形成GG、GA、AA 3種基因型（圖3）。導致編碼蛋白質的氨基酸由酸性天冬氨酸（Asp）變為極性中性天冬酰胺（Asn）（圖4）。

2.3 遺傳參數分析

遺傳參數分析結果表明，等位基因G和A的頻率分別為0.546 2和0.453 8，基因型GG、GA和AA的頻率分別為0.214 5、0.122 1和0.663 4。有效等位基因數（Ne）、遺傳雜合度（He）和多態信息含量（PIC）分別是 1.983 1、0.663 4和0.372 9。PIC介于0.25和0.50之間，屬中度多態。經χ2適合性檢測表明，荷斯坦牛在該位點已偏離Hardy-Weinberg平衡狀態（χ2=37.5215，χ20.01=6.63，P＜0.01）。從表1可以看出，GA基因型個體的實際觀測數極顯著多于理論數，AA基因型的實際觀測數極顯著少于理論數（表1）。

表1 中國荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A各基因型卡方分布Table 1 Chi-square distribution of different genotype

2.4 中國荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A突變位點與SCS及各因素之間的關聯性

用一般線性模型對TLR6基因c.640G＞A突變位點形成的不同基因型與SCS值進行分析，所得結果以“最小二乘均值±標準誤”表示（表2），基因型和胎次的交互作用見表3。多重比較結果表明，中國荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A突變位點形成的不同基因型對SCS均達到極顯著水平（P＜0.01），其中，GG基因型個體的SCS值極顯著高于GA和AA基因型個體；胎次效應顯著（P＜0.05），而產犢月份對SCS的影響不大（P＞0.05）。基因型和胎次的交互作用顯示，1胎次和2胎次中AA基因型個體的SCS值顯著低于GG基因型個體（P＜0.05）。

表2 中國荷斯坦牛TLR6基因c.640G＞A突變位點對SCS的影響Table 2 Genotype effects on SCS of TLR6 gene c.640G＞A locus mutation in Chinese Holstein

表3 胎次和TLR6基因c.640G＞A基因型對中國荷斯坦牛SCS的影響Table 3 Effects of parity and genotype of TLR6 gene c. 640G＞A locus mutation on SCS in Chinese Holstein

3 結論與討論

3.1 TLR6基因多態性較豐富

Kesh等［8］在研究移植造血干細胞病人的TLR6基因mRNA序列時，發現了3個突變位點。Pierik等［9］在腸炎病人的TLR6基因mRNA序列中發現了1個突變位點。Opsal等［5］在挪威紅牛TLR6基因mRNA序列中發現c.149G＞A 1個突變位點。Shinkai等［10-11］克隆豬TLR6基因全長序列時發現11個突變位點。儲明星等［6］研究發現，荷斯坦牛 TLR6基因存在 6個突變位點。Bergman等［12］分析了野豬與家豬TLR6基因變異差異。魏麟等［13］利用PCR-RFLPs技術檢測到豬TLR6基因c.397C＞T 1個突變位點。Xiao等［14］在廣東人TLR6基因中發現1個突變位點。本研究在寧夏荷斯坦牛TLR6基因中發現與褚明星等［6］的研究相同的c.640G＞A突變位點，并引起第70位非極性酸性天冬氨酸（Asp）變為極性中性天冬酰胺（Asn），但未發現c.638T＞A突變位點。這可能是2個研究所選用的奶牛群體不同，遺傳背景、選育方式和管理模式不盡相同而造成的。而該群體在c.640G＞A突變位點已顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態（P＜0.05），這也極可能與人工選育過程有關。

3.2 TLR6基因突變位點對SCS極顯著的影響

TLR6基因作為致病性分子受體和內生相關分子在先天性免疫系統占據重要的地位［15-16］。Opsal等［5］證明挪威紅牛TLR6基因c.149G＞A突變對乳房炎發病率的影響不顯著（P＞0.05）。Petzl等［17］對德國感染過大腸埃希菌和葡萄球菌的14頭第一泌乳期荷斯坦牛的TLR6基因進行表達分析，結果顯示基本不表達。儲明星等［6］研究發現，TLR6基因c.638T＞A、c.640G＞A和c. 1720G＞A 3個突變位點可以作為乳房炎抗性遺傳分子標記。荷斯坦牛寧夏群體TLR6基因c. 640G＞A突變產生的不同基因型對SCS極顯著相關（P＜0.01），GA型和AA型個體的SCS值極顯著低于GG型個體（P＜0.01）。基因型和胎次的交互作用顯示，1胎次和2胎次中GA型和AA基因型個體的SCS值也顯著低于GG基因型個體（P＜0.05），隨著胎次的增加，GG和GA基因型個體的SCS值有上升趨勢，而AA基因型個體的SCS值呈下降趨勢。熊本海等［18］和毛永江等［19］的研究也表明，隨著胎次的增加，SCS值呈逐漸上升趨勢。但本試驗中，SCS值在1～3胎次中逐漸上升的趨勢比較明顯，這可能與4胎次和5胎次奶牛數量較少有關。

從表1可知，本研究的GA基因型實際觀察值多于理論值，AA基因型實際觀察值少于理論值，結合表2和表3的結果可知，GA基因型和AA基因型個體的SCS值并不存在顯著差異。研究發現，編碼蛋白質活性中心的大多數氨基酸殘基為非極性的疏水氨基酸，這些小基團位置的變化，很有可能改變該蛋白質的活性中心構象，甚至空間構象，因而會進一步影響其功能的發揮。由于c.640G＞A突變位點會引起第70位非極性酸性Asp變為極性中性Asn，因此c.640G＞A極有可能導致其編碼蛋白質的高級結構發生改變，進而使荷斯坦牛信號轉導、脅迫應答和免疫應答等的生理功能發生改變。如果突變純合型個體在除SCS值以外的性狀上不存在明顯優勢，甚至有些性狀表現劣于雜合型個體的話，在長期的人工選育過程中，突變純合型AA基因型個體就會被逐漸淘汰，使AA基因型個體的實際觀察值小于其理論值。SCC/SCS是選擇降低乳腺炎發生率最合適的性狀，對低SCC/SCS牛的選擇可以降低乳腺炎發生率。因此，在荷斯坦牛育種中可以嘗試將c.640G＞A的GA基因型作為低SCC/ SCS牛的優良基因型加以應用。

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（責任編輯 張 韻）

Genetic polymorphism of TLR6 gene and its associations with somatic cell score in Chinese Holstein cattle

LI Qiang-zi1，LIU Li-xia1，YUE Bing-hui2，ZHANG Li1，*
（1.College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China；2.Qinghai Vocational and Technical Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Huangyuan 812100，China）

To search the molecular markers that are associated with mastitis and to provide theoretical basis for the Holstein cattle breeding and disease resistance，the polymoprhisms of TLR6 gene in 303 Holstein cattle in Ningxia were detected by PCR-SSCP technique，and the effect of TLR6 gene c.640G＞A locus mutation on somatic cell score （SCS）of milk and various factors was analyzed using general linear model.The results showed that there was a significant relationship between TLR6 gene c.640G＞A locus mutation and SCS and parity.The GA and AA genotype had significantly lower SCS than GG genotypes（P＜0.01）.So，GA genotype of c.640G＞A locus mutation could be applied as a low SCC/SCS superior genotypes in Chinese Holstein breeding.

Holstein cattle；TLR6 gene；c.640G＞A；somatic cell score

S823.2

A

1004-1524（2016）08-1332-06

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.09

2016-03-10

西北民族大學國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201510742084）；西北民族大學引進人才科研項目（xbmuyjrc201316）

李強子（1993—），男，河北趙縣人，本科生，研究方向為分子生物學。E-mail：lqz2015@sina.cn
*

，張麗，E-mail：shiningstar2013@sina.cn