周期素依賴性蛋白激酶5過度活性與腎小球足細胞凋亡的關系研究

陸曉華，鄭亞莉，張 霞，李 博，保 莉，羅紅艷，曹 麗，鄂 靜，張 彬，畢逢辰

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·論著·

周期素依賴性蛋白激酶5過度活性與腎小球足細胞凋亡的關系研究

陸曉華，鄭亞莉，張 霞，李 博，保 莉，羅紅艷，曹 麗，鄂 靜，張 彬，畢逢辰

目的通過在腎小球足細胞中轉染p25基因，探討周期素依賴性蛋白激酶5(Cdk5)的活性對足細胞結構及功能的影響。方法2014年度，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中培養分化成熟的小鼠離體足細胞，將足細胞分為對照組、空轉染組和p25轉染組。應用pAdTrack-CMV病毒載體克隆p25基因，并轉染足細胞，48 h收集細胞；采用Western blotting法測定Cdk5、p25、p35及細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3的表達水平；應用免疫沉淀和同位素γ-32P標記法測定Cdk5活性；足細胞免疫熒光化學染色，觀察Cdk5、p35在足細胞中的表達，以及足細胞Actin的排列情況。結果HEK293細胞Cdk5表達陽性，p35表達陰性，腎臟皮質、足細胞和腎小球中均有不同程度的Cdk5和p35的表達。對照組和空轉染組p25表達陰性，p25轉染組p25表達陽性。各組細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3表達水平和Cdk5活性比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中p25轉染組細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3表達水平和Cdk5活性高于對照組和空轉染組(P<0.05)。p25轉染組足細胞內Actin排列紊亂，細胞形態發生異常改變，對照組和空轉染組細胞內Actin排列正常，細胞形態沒有發生改變。結論p25引起Cdk5過度活性可致腎小球足細胞形態改變，Actin排列紊亂，誘發細胞凋亡。因此，Cdk5的活性在維持足細胞正常結構和功能方面發揮重要作用。

足細胞；細胞周期蛋白依賴激酶5；p35；p25；細胞凋亡

陸曉華，鄭亞莉，張霞，等.周期素依賴性蛋白激酶5過度活性與腎小球足細胞凋亡的關系研究[J].中國全科醫學，2016，19(23)：2793-2797.[www.chinagp.net]

LU X H,ZHENG Y L,ZHANG X,et al.Relationship between overactivation of Cdk5 and the glomerulus podocyte apoptosis[J].Chinese General Practice，2016，19(23)：2793-2797.

周期素依賴性蛋白激酶5(Cdk5)與其激活蛋白p35結合形成Cdk5/p35復合物，其活性與中樞神經系統疾病的發生、發展密切相關。在某些病理因素下，p35被水解形成活性更高的p25。Cdk5/p25具有神經毒性，誘發神經元凋亡，引起神經退行性病變[1]。目前發現，Cdk5和p35也存在于腎小球足細胞，并具有維持足細胞結構和功能的作用。正常足細胞中是否存在p25，以及Cdk5的過度激活復合物Cdk5/p25是否引起足細胞損害尚不明確。本研究通過在足細胞中過度表達p25，觀察Cdk5/p25活性對足細胞結構和功能的影響。

1　材料與方法

1.1抗體和試劑分化成熟的小鼠離體腎臟皮質、足細胞和腎小球標本(美國國立衛生研究院，國家糖尿病、消化系統病和腎病研究所Dr.Jeffrey Kopp實驗室提供)，HEK293細胞(美國Cayman公司)，抗Cdk5抗體(1∶1 000或1∶100)、抗p35抗體(1∶1 000或1∶100)、抗WT1抗體(1∶2 500，美國Santa Cruz公司)，抗Cleaved caspase3抗體(1∶1 000，美國Cell Signaling Technology)，抗Tubulin抗體和抗β-actin抗體(1∶3 000或1∶500，美國Sigma公司)，Roscovitine(美國ChEMBL公司)，Lipofectamin 2000基因轉染試劑、DMEM培養液(美國Invitrogen生命技術公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1細胞的培養及分組2014年度，參考文獻[2]體外培養分化成熟的小鼠離體足細胞,將細胞培養在膠原Ⅰ涂層的培養瓶或培養皿中，培養基為含10%胎牛血清的RPMI 1640，加入2 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES液，1 mmol/L丙戊酸鈉，100 U/ml青霉素和鏈霉素。將細胞放置33 ℃孵育箱，并在培養液中加10 U/ml重組鼠γ-interferon誘發細胞增生。將細胞鋪板，放置到37 ℃,5% CO2的孵育箱內培養10～14 d，使細胞分化。將細胞分為對照組、空轉染組和p25轉染組。

1.2.2p25基因轉染設計并合成p25引物[3],PCR擴增，將擴增產物進行DNA測序分析正常后，將擴增產物和腺病毒質粒載體pAdTrack-CMV用限制性酶NotI和ECORV酶切，從DNA膠里提取線性片段，將兩者混合后，37 ℃水浴 2 h，加入 DNA連接酶，獲得含有p25靶基因病毒質粒。將上述質粒轉入HEK293細胞內,繁殖48 h后收取病毒，純化并滴定最佳的轉染濃度。將足細胞鋪板于6-well培養盤，使其分化10 d后轉染空載體或攜帶有p25基因的腺病毒(1 μl/ml)，48 h后收取足細胞。

1.2.3Cdk5、p25、p35及細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3的表達采用Western blotting法測定Cdk5、p25、p35及細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3的表達水平，將提取的蛋白上樣到4%～20%的聚丙烯酰胺凝膠上，電泳分離，轉膜(100 V,90 min)。用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h；加入一抗(用封閉液稀釋)，4 ℃孵育過夜；漂洗后與山羊抗鼠或山羊抗兔的IgG(H+L)-HRP共軛二抗(1∶2 500)室溫下孵育 1～2 h；X線底片曝光，定性分析Cdk5、p35在HEK293細胞、腎臟皮質、足細胞、腎小球，以及Cdk5、p25和p35在不同轉染組中的表達；以光密度值反映細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3的表達水平。實驗重復3次。

1.2.4Cdk5活性應用免疫沉淀和同位素γ-32P標記法測定Cdk5活性，裂解細胞，提取蛋白，蛋白質比色定量分析(BCA法)進行蛋白定量分析。取300 μg蛋白加Cdk5多克隆抗體(1∶20)，4 ℃孵育過夜，次日加IgA瓊脂糖凝膠珠4 ℃孵育4 h，用細胞溶解液洗滌3次，用同位素γ-32P標記法測定Cdk5活性。實驗重復3次。

1.2.5免疫熒光化學染色4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，5%牛血清清蛋白(BSA)封閉液封閉30 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日用PBS洗滌3次,加入二抗，室溫孵育1 h，再用PBS洗滌3次，細胞核用DAPI染色5 min，加蓋載玻片。采用Zeiss LSM-510激光掃描共聚焦顯微鏡采集熒光圖像，觀察Cdk5、p35在足細胞中的表達，以及足細胞Actin的排列情況。

2　結果

2.1Cdk5、p25、p35的表達HEK293細胞Cdk5表達陽性，p35表達陰性，腎臟皮質、足細胞和腎小球中均有不同程度的Cdk5和p35的表達(見圖1)。免疫熒光化學染色顯示，足細胞Cdk5和p35表達陽性(見圖2，本文彩圖詳見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。對照組和空轉染組p25表達陰性，p25轉染組p25表達陽性(見圖3)。

注：1為HEK293細胞，2為腎臟皮質，3為足細胞，4為腎小球；Cdk5=周期素依賴性蛋白激酶5

圖1Western blotting法測定Cdk5和p35的表達

Figure 1The expression of Cdk5 and p35 detected by Western blotting

注：a示Cdk5在足細胞表達，b示p35在足細胞表達，c示足細胞核染色，d示重疊

圖2免疫熒光染色測定Cdk5和p35在足細胞中的表達(×400)

Figure 2The expression of Cdk5 and p35 in podocyte determined by immunofluorescence staining

2.2細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3的表達各組細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3表達水平和Cdk5活性比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中p25轉染組細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3表達水平和Cdk5活性高于對照組和空轉染組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3細胞結構和形態改變p25轉染組足細胞內Actin排列紊亂，細胞形態發生異常改變，對照組和空轉染組細胞內Actin排列正常，細胞形態沒有發生改變(見圖4)。

注：1為對照組,2為空轉染組，3為p25轉染組

圖3各組細胞轉染后Cdk5、p25和p35的表達

Figure 3The expression of Cdk5,p25 and p35 among different transfected cells group

3　討論

Cdk5是細胞周期素依賴蛋白激酶家族的特殊成員，是脯氨酸限制性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，Cdk5并不直接參與細胞周期的調節，主要通過對其底物的磷酸化來發揮功能。生理情況下，與p35結合而被激活，在維持神經元和胰島細胞正常功能中發揮重要作用[3-4]。

在神經退行性疾病，如阿爾茨海默病的發生過程中，Cdk5通過如下機制誘導神經元的凋亡，首先p35被水解形成分子量更小的多肽片段p25，并與Cdk5結合形成活性更高的Cdk5/p25復合物，使得Cdk5被過度激活，過度激活的Cdk5具有明顯的神經毒性，通過誘導神經元中tau的異常磷酸化，導致神經元骨架破壞，誘發神經元的凋亡，使得機體相應的功能發生障礙[5-6]。足細胞是腎小球基底膜外高度分化的細胞，參與腎小球的細胞濾過屏障。目前發現，Cdk5和p35也存在于腎小球足細胞，并具有維持足細胞結構和功能的作用。本研究通過在足細胞中轉入p25基因觀察Cdk5/p25活性對足細胞結構和功能的影響。

Table 1The expression of apoptosis related protein Cleaved caspase3 and Cdk5 activition among different groups

組別光密度值Cdk5活性(×103CPM)對照組133±17 3.8±0.2空轉染組159±20 3.8±0.3p25轉染組409±17ab26.3±0.5abF值26.58025.320P值<0.001<0.001

注：Cdk5=周期素依賴性蛋白激酶5；與對照組比較，aP<0.05；與空轉染組比較，bP<0.05

圖4　各組Actin的排列和細胞形態(免疫熒光化學染色，×400)

前期研究發現，正常分化成熟的離體足細胞有Cdk5和p35的表達，Cdk5/p35活性在維持足細胞生理結構和功能中發揮一定作用[7-8]，該結果在本研究中進一步得到證實。本研究發現，在正常腎組織和足細胞中沒有p25表達。將p25基因轉染足細胞時，Cdk5活性被過度活化，使細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase3表達水平升高，足細胞內Actin排列紊亂，細胞形態發生異常改變，細胞凋亡增加，與神經元和胰島β細胞中誘發和轉入p25基因的研究結果相同[9-12]。說明p25過度激活Cdk5的活性引起細胞凋亡這一途徑在足細胞的凋亡中也同樣發生。

腎小球足細胞是一種終末分化的上皮細胞，生理情況下附著在腎小球基底膜外，是腎小球細胞最后一道屏障，損傷后無再生能力[13]，足細胞損傷常被認為是導致各種腎小球疾病發生和發展的關鍵因素，足細胞的破壞已成為反映腎臟損傷嚴重程度和進展的重要評判指標。因此，p25可引起足細胞結構紊亂、誘發細胞凋亡，對研究引起腎小球足細胞損傷的原因、凋亡的機制以及足細胞損傷的治療具有重要意義。

綜上所述，生理情況下足細胞中沒有p25的表達，Cdk5被p35激活，在維持足細胞結構的穩定和生理功能中發揮重要作用。病理情況下，足細胞中表達p25也可引起Cdk5的過度激活，引起足細胞結構紊亂，形態改變，誘發足細胞凋亡。但誘發p25產生的病理情況以及Cdk5過度激活引起足細胞凋亡的機制有待于進一步深入研究。

作者貢獻：陸曉華、鄭亞莉進行課題設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張霞、李博、保莉、羅紅艷、曹麗、鄂靜、張彬、畢逢辰進行課題實施、評估、資料收集；鄭亞莉進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Relationship Between Overactivation of Cdk5 and the Glomerulus Podocyte Apoptosis

LUXiao-hua,ZHENGYa-li,ZHANGXia,LIBo,BAOLi,LUOHong-yan,CAOLi,EJing,ZHANGBin,BIFeng-chen.

DepartmentofNephrology,NingxiaPeople′sHospital,Yinchuan750021,China

ZHENGYa-li,DepartmentofNephrology,NingxiaPeople′sHospital,Yinchuan750021,China；E-mail：424570556@qq.com

ObjectiveTo study the influence of Cdk5 activity on the structure and function of glomerulus podocyte by transfection of p25 gene.MethodsIn 2014，differentiated and mature isolated mouse podocytes were cultured in RPMI 1640 medium with 10% fetal bovine serum and divided into three groups including control group,empty group and p25 group.p25 gene was cloned through the pAdTrack-CMV viral vector,and transfected into podocytes.After 48 hours,cells were collected for further analysis.Cdk5,p25,p35,Cleaved caspase3 expressions were detected by Western blotting method;Cdk5 activity were tested through immunoprecipitation and isotope γ-32P marking methods.In order to observe the expression of Cdk5，p35 and structure of Actin in podocyte,immunofluorescent staining were conducted.ResultsCak5 in HEK293 cells had positive expression while p35 had negative expression;there were different levels of Cdk5 and p35 in renal cortex,podocyte and glomerulus.p25 had negative expression in control group and empty group while positive expression in p25 group.As for the expression levels of Cleaved caspase3 and Cdk5 activity in different groups,differences were of statistical significance(P<0.05);the expression levels of Cleaved caspase3 and Cdk5 activity in p25 group was higher than those in the other two groups(P<0.05).In p25 group,Actin within podocyte were arranged in disorder and forms of cells were abnormal,while those conditions were on the contrary in the other two groups.Conclusionp25 causes overactivation of Cdk5 and induces podocyte morphological change,Actin arrangement disorder and cell apoptosis.Therefore,Cdk5 activity plays an important role in maintaining normal structure and function of podocyte.

Podocytes；Cyclin-dependent kinase 5；p35；p25；Apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81160093，81460161)；寧夏自然科學基金資助項目(NZ14160)；寧夏科技支撐基金資助項目(2013ZYS103)

750021寧夏銀川市，寧夏回族自治區人民醫院 西北民族大學醫學院第一附屬醫院腎內科(陸曉華，鄭亞莉，張霞，李博，保莉，羅紅艷，曹麗，鄂靜，畢逢辰)；寧夏醫科大學研究生學院(張彬)

鄭亞莉，750021寧夏銀川市，寧夏回族自治區人民醫院 西北民族大學醫學院第一附屬醫院腎內科；E-mail：424570556@qq.com

R 322.61

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.23.011

2015-11-24；

2016-04-25)