24小時快速眼動睡眠剝奪對青少年期C57BL/6J小鼠空間學習記憶能力和海馬一氧化氮水平的影響研究

郝彥利，黃鑫焱，THOIDINGJAM Bidyarani Chanu，張 斌

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·論著·

24小時快速眼動睡眠剝奪對青少年期C57BL/6J小鼠空間學習記憶能力和海馬一氧化氮水平的影響研究

郝彥利，黃鑫焱，THOIDINGJAM Bidyarani Chanu，張 斌

目的探討24 h快速眼動睡眠剝奪(REMSD)對青少年期C57BL/6J小鼠空間學習記憶能力和海馬一氧化氮(NO)水平的影響。方法2014年1月—2015年1月選取45只青少年期(3～4周齡)SPF級雄性C57BL/6J小鼠，采用隨機數字表法將小鼠分為對照組、寬平臺組和REMSD組，各15只。將REMSD組小鼠置于水平臺睡眠剝奪箱建立REMSD模型，寬平臺組小鼠置于假水平臺睡眠剝奪箱建立快速眼動睡眠假剝奪模型。通過3輪Morris水迷宮定位航行實驗測試小鼠學習能力，記錄逃避潛伏期；Morris水迷宮空間搜索實驗測試小鼠記憶能力，記錄小鼠穿臺次數，在靶象限停留時間以及在靶象限游動距離。頸椎脫臼處死小鼠，分離海馬，采用NO檢測試劑盒檢測NO水平。結果REMSD組小鼠出現多動，毛發潮濕凌亂且光澤度差，四肢充血，煩躁不安，易激惹，興奮性增強。各組小鼠3輪Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，REMSD組逃避潛伏期均較對照組、寬平臺組縮短(P<0.05)。各組小鼠穿臺次數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中，REMSD組小鼠穿臺次數多于對照組和寬平臺組(P<0.05)。對照組、寬平臺組、REMSD組海馬NO水平分別為(43.6±8.5)、(45.8±9.1)、(54.2±5.8)μmol/L，差異有統計學意義(F=7.460，P=0.002)；其中，REMSD組小鼠海馬NO水平高于對照組和寬平臺組(P<0.05)。結論青少年期小鼠REMSD 24 h后，學習記憶能力提高，可能與海馬NO水平升高有關。

睡眠,快速眼運動；青少年；學習；記憶；一氧化氮

郝彥利，黃鑫焱，THOIDINGJAM Bidyarani Chanu，等.24小時快速眼動睡眠剝奪對青少年期C57BL/6J小鼠空間學習記憶能力和海馬一氧化氮水平的影響研究[J].中國全科醫學，2016，19(23)：2798-2801.[www.chinagp.net]

HAO Y L,HUANG X Y,THOIDINGJAM B C,et al.Effect of 24 h rapid eye movement sleep deprivation on the spatial learning and memory ability and nitric oxide level of hippocampus in adolescent C57BL/6J mice[J].Chinese General Practice，2016，19(23)：2798-2801.

ZHANGBin，DepartmentofPsychology，NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510445,China；E-mail:zhang73bin@hotmail.com

青少年期是由幼年期向成年期過渡的特殊時期，與成年期相比，青少年期中樞神經系統突觸結構和功能發育有其獨特的特點，如大腦快速發育，神經突觸過度增長，然后快速剪除[1]。人類青少年期為12～18歲，此時正處于中學階段，面臨沉重的學習壓力，導致青少年短暫睡眠不足廣泛存在。快速眼動睡眠(REMS)是重要的睡眠階段[2]，臨床和動物研究發現，REMS可促進機體的學習記憶[3-4]。與成年人相比，青少年REMS頻率高、持續時間長[5]，因此REMS對青少年期腦功能的影響可能更明顯。海馬與前額葉皮質、額葉皮質、基底核等存在豐富的神經環路聯系，因此海馬在機體學習和記憶過程中發揮了重要作用。一氧化氮(NO)是機體最小的氣態生物信使分子，也是一種活躍的生物自由基，其作為重要的神經遞質，參與了海馬突觸傳遞的長時程增強(LTP)和學習記憶形成過程[6]。然而，REMS對青少年期學習記憶能力和海馬NO水平的影響相關研究較少。本研究通過水平臺方法建立REMS剝奪(REMSD)模型，觀察比較REMSD對青少年期C57BL/6J小鼠空間學習記憶能力和海馬NO水平的影響，以探討REMS對青少年期小鼠腦功能的作用及其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物2014年1月—2015年1月選取45只青少年期(3～4周齡)SPF級雄性C57BL/6J小鼠(來源于廣東省實驗動物中心)，許可證號SCXK(粵)2008-0002。小鼠分籠飼養，每籠4～5只，分別于8：00、20：00室內明暗自動切換，照明時采用40 W日光燈，自由攝取標準水和食物，保持室內相對濕度40%～70%，溫度22～24 ℃，避免噪聲。采用隨機數字表法將小鼠分為對照組、寬平臺組和REMSD組，各15只。

1.2方法

1.2.1模型建立將REMSD組小鼠置于水平臺睡眠剝奪箱。水平臺睡眠剝奪箱為開口水箱(70 cm×50 cm×50 cm)，內含9個圓形小平臺(高10 cm，直徑1.5 cm，高于水面以上0.5 cm)，平臺均間隔4 cm；小鼠可自由從一個平臺跳躍到另一個平臺來實現自由走動，但不能同時跨立在兩個平臺上。當小鼠站立在小平臺上開始進入REMS時，小鼠出現全身肌肉張力降低及節律性垂頭，導致落水后驚醒，從而建立REMSD模型。寬平臺組為REMS假剝奪組，即將小鼠置于假水平臺睡眠剝奪箱。假水平臺睡眠剝奪箱為開口水箱(70 cm×50 cm×50 cm)，內含6個圓形大平臺(高10 cm，直徑12 cm，高于水面以上0.5 cm)，平臺均間隔4 cm，小鼠可自由從一個平臺跳躍到另一個平臺來實現自由走動，但不能同時跨立在兩個平臺上。小鼠可以在大平臺上安然進入REMS并不會掉落入水中，從而建立REMS假剝奪模型。模型建立于12:00開始，至次日12:00結束。期間，對照組小鼠活動不受任何干擾。

1.2.2Morris水迷宮實驗模型建立后，立即對各組小鼠通過Morris水迷宮實驗測試學習和記憶能力。Morris水迷宮定位航行實驗：將小鼠面朝Morris水迷宮內壁并放入任意一個象限中入水點進行訓練，計時60 s，視頻分析系統自動記錄小鼠運動軌跡，如果小鼠在60 s內找到并爬上隱藏在水下的平臺停留2 s則表示上臺成功，記錄其入水到上平臺時間，即逃避潛伏期；如果60 s內小鼠未找到平臺，則終止實驗后引導其上平臺，逃避潛伏期記錄為60 s。每只小鼠在4個象限中各訓練一次，共4次記為一輪，取4次逃避潛伏期平均值為此輪最終數據。小鼠共經過3輪測試，每輪間隔1 h。每輪結束后，小鼠用布擦干，并放回原環境。

Morris水迷宮空間搜索實驗：于Morris水迷宮定位航行實驗結束3 h后開始空間搜索實驗，實驗前先撤出Morris水迷宮中的水平臺，將小鼠面朝Morris水迷宮內壁并放入任意一個象限的入水點，計時60 s。觀察并記錄小鼠穿臺次數，在靶象限停留時間以及在靶象限游動距離。

1.2.3海馬NO水平檢測Morris水迷宮實驗結束后立即頸椎脫臼處死小鼠，冰皿上快速分離出海馬體并稱重，在冰水浴下將海馬體置于含苯甲基磺酰氟(PMSF)的組織裂解液(400∶1)中進行快速間斷電動勻漿(25 000 r/min)10 min，4 ℃低溫下在低溫離心機中以12 000 r/min離心5 min(離心半徑為18 cm)，取其上清液置于-80 ℃超低溫冰箱待用。使用BCA蛋白測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)按說明書步驟測定上清液蛋白水平，使用NO檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)按說明書步驟分別加入50 Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，在波長570 nm處采用酶標儀測定各孔吸光度值，繪制標準曲線。根據待測樣本吸光度值和標準曲線，計算待測樣本NO水平。

2　結果

2.1基本情況各組小鼠無死亡及逃逸現象。對照組與寬平臺組小鼠行為未見明顯異常；REMSD組小鼠出現多動，毛發潮濕凌亂且光澤度差，四肢充血，煩躁不安，易激惹，興奮性增強。

2.2Morris水迷宮定位航行實驗各組小鼠3輪Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，REMSD組逃避潛伏期較對照組、寬平臺組縮短，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1Comparison of escape latency in Morris water maze place navigation test of mice among each group

組別只數第1輪第2輪第3輪對照組1544.4±4.543.9±2.941.2±3.4寬平臺組1547.3±2.945.8±3.943.2±3.7REMSD組1537.4±3.4ab34.2±3.6ab28.2±3.0abF值5.3076.0049.441P值0.0360.0270.002

注：與對照組比較，aP<0.05；與寬平臺組比較，bP<0.05；REMSD=快速眼動睡眠剝奪

2.3Morris水迷宮空間搜索實驗各組小鼠靶象限停留時間、游動距離及其百分比比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。各組小鼠穿臺次數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中，REMSD組小鼠穿臺次數多于對照組和寬平臺組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table 2Comparison of spatial probe test results in Morris water maze of mice among each group

組別只數穿臺次數(次)靶象限停留時間(s)靶象限停留時間百分比(%)靶象限游動距離(cm)靶象限游動距離百分比(%)對照組150.6±0.318.1±5.430.4±6.5258±6333.4±6.3寬平臺組150.6±0.117.9±4.229.5±2.8252±7831.5±3.1REMSD組151.4±0.2ab14.7±6.025.2±5.0266±8427.2±4.2F值6.3072.1741.9370.8701.189P值0.0290.3880.2940.6040.372

注：與對照組比較，aP<0.05；與寬平臺組比較，bP<0.05

2.4海馬NO水平對照組、寬平臺組、REMSD組海馬NO水平分別為(43.6±8.5)、(45.8±9.1)、(54.2±5.8)μmol/L，差異有統計學意義(F=7.460，P=0.002)；其中，REMSD組小鼠海馬NO水平高于對照組和寬平臺組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

3　討論

本研究發現，REMSD組小鼠學習記憶能力增強，海馬NO水平升高。CLéMENT等[7]研究發現，REMSD 72 h后，海馬、前額葉皮質、基底前腦等與學習記憶相關的腦區內NO水平上升。RYTK?NEN等[8]通過觸摸方法進行REMSD 3 h后發現，小鼠基底核NO水平升高。調控NO合成的酶主要有神經元型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、上皮型一氧化氮合酶(eNOS)。nNOS廣泛表達于前額葉皮質、基底核、海馬、中腦等腦區。研究發現，nNOS在REMS啟動和維持等方面發揮重要作用[9]。同時，REMS也影響了nNOS的表達和活性。有研究通過水平臺方法進行REMSD 24 h后發現，大鼠大腦皮質、海馬等區域nNOS表達和活性增高[10-11]。iNOS是一種不依賴Ca2+的一氧化氮合酶。在正常神經系統中，iNOS主要表達于神經膠質細胞內，引導神經突觸的發育和神經遞質的傳遞[12]。在神經系統受到損傷時，iNOS在神經膠質細胞高表達，產生過量NO，加重神經元損傷。CLéMENT等[13]對老年大鼠研究發現，iNOS表達于中顱神經元，并且參與了REMS的發動和維持。既往研究未發現iNOS在正常成年大鼠神經元內表達，但是，REMSD后的大鼠基底前顱神經元內出現iNOS表達，并且隨著REMSD時間的延長，表達iNOS神經元數量增多[8]。由此可見，REMSD可能導致神經元耗氧量增多，激活nNOS和iNOS的表達和活性，上調神經元內NO水平。

綜上所述，短時間REMSD可能通過促進NO合成適度增加，促進青少年期小鼠學習記憶能力。

作者貢獻：郝彥利進行課題設計與實施、資料收集整理、成文并對文章負責；黃鑫焱和THOIDINGJAM Bidyarani Chanu進行課題設計與實施、評估、資料收集整理；張斌進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]GIEDD J N.Structural magnetic resonance imaging of the adolescent brain[J].Ann N Y Acad Sci,2004,1021:77-85.

[2]YOO S S,HU P T,GUJAR N,et al.A deficit in the ability to form new human memories without sleep[J].Nat Neurosci,2007,10(3):385-392.

[3]MUELLER A D,POLLOCK M S,LIEBLICH S E,et al.Sleep deprivation can inhibit adult hippocampal neurogenesis independent of adrenal stress hormones[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2008,294(5):1693-1703.

[4]LEE Y J,CHO S J,CHO I H,et al.Insufficient sleep and suicidality in adolescents[J].Sleep,2012,35(4):455-460.

[5]VAN DER WERF Y D,VAN DER HELM E,SCHOONHEIM M M,et al.Learning by observation requires an early sleep window[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(45):18926-18930.

[6]SANCHEZ-RUILOBA L,AICART-RAMOS C,GARCIA-GUERRA L,et al.Protein kinase D interacts with neuronal nitric oxide synthase and phosphorylates the activatory residue serine 1412[J].PLoS One,2014,9(4):e95191.

[7]CLéMENT P,GHARIB A,CESPUGLIO R,et al.Changes in the sleep-wake cycle architecture and cortical nitric oxide release during ageing in the rat[J].Neuroscience,2003,116(3):863-870.

[8]RYTK?NEN K M,WIGREN H K,KOSTIN A,et al.Nitric oxide mediated recovery sleep is attenuated with aging[J].Neurobiol Aging,2010,31(11):2011-2019.

[9]ANAEIGOUDARI A,SOUKHTANLOO M,SHAFEI M N,et al.Neuronal nitric oxide synthase has a role in the detrimental effects of lipopolysaccharide on spatial memory and synaptic plasticity in rats[J].Pharmacol Rep,2016,68(2):243-249.

[10]BURLET S,LEGER L,CESPUGLIO R.Nitric oxide and sleep in the rat:a puzzling relationship[J].Neuroscience,1999,92(2):627-639.

[11]CAVAS M,NAVARRO J F.Effects of selective neuronal nitric oxide synthase inhibition on sleep and wakefulness in the rat[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2006,30(1):56-67.

[12]CESPUGLIO R,AMROUNI D,MEILLER A,et al.Nitric oxide in the regulation of the sleep-wake states[J].Sleep Med Rev,2012,16(3):265-279.

[13]CLéMENT P,SARDA N,CESPUGLIO R,et al.Potential role of inducible nitric oxide synthase in the sleep-wake states occurrence in old rats[J].Neuroscience,2005,135(2):347-355.

[14]YANG S R,SUN H,HUANG Z L,et al.Repeated sleep restriction in adolescent rats altered sleep patterns and impaired spatial learning/memory ability[J].Sleep,2012,35(6):849-859.

[15]KIM-SHAPIRO D B,SCHECHTER A N,GLADWIN M.Unravelling reactions of nitric oxide,nitrite,and haemoglobin in physiology and therapeutics[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(4):697-705.

(本文編輯：吳立波)

Effect of 24 h Rapid Eye Movement Sleep Deprivation on the Spatial Learning and Memory Ability and Nitric Oxide Level of Hippocampus in Adolescent C57BL/6J Mice

HAOYan-li,HUANGXin-yan,THOIDINGJAMBidyaraniChanu,ZHANGBin.

DepartmentofAnatomy,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China

HAOYan-li，DepartmentofAnatomy,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China；E-mail:haoyanli26@126.com

ObjectiveTo explore the effect of 24 h rapid eye movement sleep deprivation(REMSD) on spatial learning and memory ability and nitric oxide(NO) level of hippocampus in adolescent C57BL/6J mice.MethodsFrom January 2014 to January 2015,45 adolescent male C57BL/6J mice(3-4 weeks old) at SPF level were selected.Random number table method was used to divide the mice into control group,wide platform(WP) group and REMSD group with 15 in each group.Mice in REMSD group were put into sleep deprivation water tank to establish REMSD model,while mice in WP group were put into artificial water tank to establish REMS fake deprivation model.Three-round place navigation of Morris water maze was applied to test the learning ability and record the escape latent period;spatial probe test of Morris water maze was used to test the memory ability of mice,record times of mice crossing platforms,standing time and the moving distance in the target quadrant.Mice were sacrificed by cervical dislocation to separate hippocampus and test NO level by using NO detection kit.ResultsMice in REMSD group presented hyperactivity,wet and messy hair with poor glossiness,limbs congestion,agitated activity，irritability and enhanced excitability.There was significant difference in the escape latent period among mice in each group in the three-round Morris maze place navigation test(P<0.05);the escape latent period of REMSD group was significantly shorter than that of control group and WP group(P<0.05).There was significant difference in the times of mice crossing platforms in each group(P<0.05);the times of mice crossing platforms in REMSD group was significantly more than that of control group and WP group(P<0.05).NO level of hippocampus of control group,WP group and REMSD group was(43.6±8.5),(45.8±9.1),and(54.2±5.8) μmol/L respectively,showing significant differences(F=7.460，P=0.002);NO level in hippocampus of mice in REMSD group was significantly higher than that of control group and WP group(P<0.05).ConclusionThe ability of learning and memorization of mice in adolescent period has improved after 24 h REMSD,and this may be related with the increasing NO level of hippocampus.

Sleep，rapid eye movement;Adolescent;Learning;Memory;Nitric oxide

廣東省科技廳社會發展領域科技計劃項目(2013B021800045,2014A020212563)

511436廣東省廣州市，廣州醫科大學人體解剖教研室(郝彥利),留學生學院(THOIDINGJAM Bidyarani Chanu)；廣州醫科大學附屬第六醫院神經內科(黃鑫焱)；南方醫科大學南方醫院心理科(張斌)

郝彥利，511436廣東省廣州市，廣州醫科大學人體解剖教研室；E-mail:haoyanli26@126.com

張斌，510445廣東省廣州市，南方醫科大學南方醫院心理科；E-mail:zhang73bin@hotmail.com

R 339.141

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.23.012

2016-03-17；

2016-06-20)