“題說”2015年高考題中的微生物計數法

韓翠翠

(江蘇省南京市江寧高級中學 211100)

高中階段學生所學的微生物的計數方法有顯微鏡直接計數法和稀釋涂布平板法，高考題中經常出現對這兩種方法的考核，如2015年高考江蘇卷第3題、新課標I卷第39題和四川卷第3題。然而在解題中，學生常常會對這兩種方法的實驗原理和計數搞混淆。現將這兩種方法進行比較，并輔以例題進行解析，以便學生理解應用。

1 實驗原理

1.1 顯微鏡直接計數法 顯微鏡直接計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板(也叫做血細胞計數板)，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌不易看清。

血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數區，計數區的刻度有兩種：一種是一個大方格分成25個中方格，每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，每個中方格又分成25個小方格。但是，不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。計數區邊長為1mm，則計數區的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，計數區的高度為0.1mm，所以每個計數區的體積為0.1mm3。

例1 (2015江蘇高考卷·13) 血細胞計數板是對細胞進行計數的重要工具，下列敘述正確的是

A．每塊血細胞計數板的正中央有1 個計數室

B．計數室的容積為1mm×1mm×0. 1mm

C．蓋蓋玻片之前,應用吸管直接向計數室滴加樣液

D．計數時,不應統計壓在小方格角上的細胞

解析：每塊血細胞計數板的正中央有2個計數室，A錯誤；每個計數室的容積有1mm×1mm×0.1mm，B正確；向血細胞計數板中滴加樣液前應先蓋上蓋玻片，讓樣液自行滲入計數室，若先滴加樣液，統計結果會偏大，C錯誤；計數時，需統計小方格內以及小方格相鄰兩邊及其頂角的細胞，D錯誤。答案：B。

1.2 稀釋涂布平板法 稀釋涂布平板法是根據微生物在固體培養基上所形成的單個菌落這一培養特征設計的計數方法，即一個菌落代表一個單細胞。計數時，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開，使之成單個細胞存在(否則一個菌落就不只是代表一個細胞)，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板上，使其均勻分布于平板中的培養基內。經培養后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數。該法一般用于某些成品檢定(如殺蟲菌劑等)、生物制品檢驗、土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗。

2 計數方法

2.1 血細胞計數板的計數方法 顯微鏡直接計數法要用到血球計數板，使用血球計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數量。計數時，如使用規格為16×25型的血球計數板，則在計數室內選4個中方格(左上、右上、左下、右下4個角)中的菌體進行計數，若使用規格為25×16型的血球計數板，則在計數室內選5個中方格(4個角和中央)中的菌體進行計數。對于位于格線上的菌體，一般只統計兩條格線上的菌體，按照“數上不數下，數左不數右”的原則計數。分別記錄所選中方格中的菌體數，再算出每個小方格內菌體數的平均值，乘以400，就能得出一個大方格中菌體的總數，然后換算出1mL懸液中菌體總數。(已知：1mL=10mm×10mm×10mm= 1000mm3； 0.1mm3=10-4mL；1mL懸液中待測菌體總數=1個小方格中菌體平均數×400×104×稀釋倍數)。

例2 在“探究培養液中酵母菌種群數量變化”的實驗中，將酵母菌培養液稀釋103倍后，用血細胞計數板(規格為1mm×1mm×0.1mm)進行計數，觀察圖1的視野。有關敘述錯誤的是

圖1 顯微鏡下視野

A．血細胞計數板計數時，應先在計數室上方加蓋玻片，再滴加少量樣液

B．計數同一樣品時，可對同一計數板上的兩個計數室進行計數，并取平均值

C．滴加培養液后應立即計數，以防止酵母菌沉降到計數室底部

D．若僅依據圖示結果，可以估算培養液中酵母菌密度為3.5×109個/mL

解析：血球計數板使用時應該先蓋蓋玻片，再滴加樣液，所以A正確。一塊血球計數板上有兩個計數室，可以對同一計數板上的兩個計數室進行計數，并取平均值，所以B正確。滴加培養液后，要等酵母菌沉降到計數室底部再計數，不應立即計數，所以C錯誤。若僅依據圖示結果，可以看出一個中方格有14個酵母菌，其含有16個小方格，則一個小方格含酵母菌平均數為0.875個，則該培養液酵母菌密度為0.875×400×104×103=3.5×109個/mL。答案：C。

2.2 稀釋涂布平板法的計數方法 該法統計菌落數目的理論依據是：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。因此，恰當的稀釋度是成功地統計菌落數目的關鍵。為了保證結果準確，通常將幾個稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養后再選擇菌落數在 30～300的平板進行計數(每克土壤樣品的細菌數=某一稀釋度幾次重復培養后的菌落平均數/涂布所用的稀釋液的體積×稀釋倍數)。

例3 某同學計劃統計食醋中該發酵菌的總數，他選用10-4、10-5、10-6稀釋液進行涂布，每種稀釋液都設置了3個培養皿。從設計實驗的角度看，還應設置一組對照實驗是________。該同學在稀釋倍數為10-4的培養基中測得平板上菌落數的平均值40.4，則每毫升樣品中的菌體數________個(涂布平板時所用稀釋液的體積0.2mL)。

解析：生物學設計實驗的原則是對照原則，因此還應設置一組不接種的空白培養基作為對照組，以檢測培養基滅菌是否徹底。每克樣品中菌體個數=(40.4/0.2)×104=2.02×106。答案：一組不接種的空白培養基 2.02×106。

3 計數結果與待測樣品中實際含菌數量比較

顯微鏡直接計數法的缺點是不能區分死菌和活菌，因此計數結果與待測樣品中實際含菌數量相比往往偏高。

為了避免把死菌計數在內，可以對待測菌體染色，如“觀察酵母菌的種群數量的動態變化”實驗，用臺盼藍染色，被染成藍色的，為死菌。反之，為活菌。

稀釋涂布平板法常用來統計樣品中活菌的數目，統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，原因是樣品一般不易完全分散成單個個體，而且當兩個或多個活細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。

例4 (2015年新課標I·39)已知微生物A可以產生油脂，微生物B可以產生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生產。回答有關問題：

(1)顯微觀察時，微生物A菌體中的油脂通常可用于________染色。微生物A產生的油脂不易揮發，可選用________(填“萃取法”或“水蒸氣蒸餾法”)從菌體中提取。

(2)為了從自然界中獲得能產生脂肪酶的微生物B的單菌落，可從含有油料作物種子腐爛物的土壤中取樣，并應選用以________為碳源的固體培養基進行培養。

(3)若要測定培養液中微生物B的菌體數，可在顯微鏡下用________直接計數；若要測定其活菌數量，可選用________法進行計數。

(4)為了確定微生物B產生的脂肪酶的最適溫度，某同學測得相同時間內，在35℃、40℃、45℃溫度下降解10g油脂所需酶量依次為4mg、1mg、6mg，則上述三個溫度中，________℃條件下該酶活力最小。為了進一步確定該酶的最適溫度，應圍繞________℃設計后續實驗。

解析：(1)油脂可被蘇丹III染液或者蘇丹IV染液染成橘黃色或紅色。由于不易揮發，故采用萃取法。(2)脂肪酶的微生物B可以分解脂肪，故可以以脂肪為碳源的固體培養基進行培養，不產生脂肪酶的微生物無法生存。(3)微生物B的菌體數，可在顯微鏡下用血細胞計數板直接計數，活菌用稀釋涂布平板法。(4)45℃降解10g油脂所需酶量最大，故酶活性最小；40℃溫度下降解10g油脂所需酶量最小，故酶活性最大，圍繞40℃溫度進行后續實驗設計。答案：(1)蘇丹III(或者蘇丹IV) 萃取法 (2)油脂 (3)血細胞計數板 稀釋涂布平板 (4)45 40。