淫羊藿苷對激素抵抗型腎病綜合征大鼠足細胞PODXL/Ezrin蛋白及Caspase-3、Bax、Bcl-2表達的影響

王曉輝，戴恩來，段淑文，劉燦，丁照然

甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

激素抵抗型腎病綜合征（steroid resistant nephrotic syndrome，SRNS）是一種臨床表現為對標準類固醇治療缺乏反應的疾病[1]，其特點是類固醇抵抗性、臨床變異性和遺傳異質性[2]。目前未見經過驗證的生物標志物能預測SRNS或定義調節SRNS的途徑[3]。SRNS治療困難，易發展為終末期腎病，生存率低，迫切需要逆轉類固醇耐藥性及減少長期使用高劑量類固醇藥物的措施[4]。SRNS發病機制伴隨腎小球上皮細胞（足細胞）凋亡[5-6]，因此，抑制足細胞凋亡是SRNS一種潛在的治療策略。淫羊藿苷（icariin，ICA）在神經退行性疾病、心血管疾病、抗骨質疏松、抗炎、抗氧化應激、抗抑郁和抗腫瘤等方面有多種藥理作用[7-9]，對腎臟疾病具有保護作用，在提高糖皮質激素療效方面有一定優勢[10]，但其機制有待進一步探索。在前期研究基礎上，本研究進一步觀察ICA對足細胞相關蛋白及凋亡的影響，探討其減輕足細胞損傷的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SPF級SD大鼠60只，體質量（180±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養于甘肅中醫藥大學動物實驗中心，溫度22 ℃，濕度30%～50%，輻照滅菌SPF級大鼠飼料及飲用水喂養。本研究經甘肅中醫藥大學實驗動物管理（倫理）委員會審批（2021-181）。

1.2 藥物

ICA，陜西博林生物技術有限公司，批號BL20211102001。潑尼松片，山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司，批號211007。鹽酸阿霉素（ADR），北京索萊寶科技有限公司，批號HY-15142。

1.3 主要試劑與儀器

Caspase-3抗體（批號GTX110543）、Bax抗體（批號GTX635715）、Bcl-2抗體（批號GTX100064）、Ezrin抗體（批號GTX111709），美國Gene Tex公司；PODXL抗體（批號bs-1345R），北京博奧森生物技術有限公司；β-actin（批號GB12001）、HRP標記山羊抗兔二抗（批號GB23303），武漢賽維爾生物科技有限公司；TUNEL試劑盒（批號G1501），武漢賽維爾公司；CCB法尿蛋白檢測試劑盒（貨號C035-2-1），南京建成生物工程研究所。7600-1101SE型全自動血液生化分析儀（日立診斷產品有限公司），ECLIPSE C1、E100正置熒光顯微鏡（日本尼康），DS-U3成像系統（日本尼康），BT-2電泳儀（武漢賽維爾公司），TSY-B搖床（武漢賽維爾公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

60只SD大鼠隨機分為空白組12只，其余48只分別于實驗第1、8日注射ADR 4、3.5 mg/kg建立SRNS大鼠模型[11]。造模14 d后將大鼠隨機分為模型組、激素組、ICA組和聯合組，每組12只。激素組予0.63 mg/mL潑尼松溶液（生理鹽水配制）6.3 mg/kg灌胃，ICA組予5 mg/mL ICA溶液（生理鹽水配制）50 mg/kg灌胃，聯合組同時予潑尼松和ICA溶液灌胃，空白組及模型組予生理鹽水，灌胃體積1 mL/100 g，連續6周。實驗期間每周稱量大鼠體質量。

2.2 標本采集

第2次注射ADR后開始檢測尿蛋白，提前1 d用代謝籠收集大鼠24 h尿液，每周1次。干預結束后，以2%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，心尖取血，室溫靜置1 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，用于檢測生化指標。切除大鼠左側腎臟，生理鹽水清洗，剝離腎包膜，用于腎組織病理檢測，右側腎組織用于蛋白檢測。

2.3 腎功能指標測量

CCB法試劑盒測定24 h尿蛋白（24 h-UTP）含量；采用全自動血液生化分析儀檢測血清白蛋白（ALB）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）含量。

2.4 腎組織病理學檢測

將腎臟切成厚度0.5 cm組織，裝入EP管中，加入4%組織細胞固定液，常溫固定48 h，經洗滌固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，行Masson染色，光學顯微鏡下觀察腎組織病理形態。

2.5 Western blot檢測

稱取適量腎組織剪碎，加入組織蛋白裂解液，勻漿，4 ℃、10 080×g離心10 min，收集上清液，紫外分光光度計測定蛋白濃度。樣品上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入Caspase-3、Bax、Bcl-2、PODXL、β-actin一抗（1∶1 000）和Ezrin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗膜，室溫孵育二抗2～3 h。DAB顯色，電化學發光顯色液曝光，用Image J軟件對圖像進行灰度分析。

2.6 TUNEL染色檢測細胞凋亡

石蠟切片脫蠟至水，蛋白酶K修復，破膜，緩沖液常溫孵育10 min，加入TUNEL反應液，37 ℃加濕室中孵育2 h，PBS緩沖液清洗，滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min，脫水、封片后，熒光顯微鏡下觀察腎組織凋亡情況，計算TUNEL陽性表達熒光強度。

3 統計學方法

4 結果

4.1 淫羊藿苷對模型大鼠體質量的影響

模型組死亡2只，最終各組按10只進行統計。與空白組比較，模型組大鼠體質量增長緩慢，造模14 d及給藥6周后體質量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，激素組大鼠體質量無明顯差異（P＞0.05），ICA組和聯合組大鼠體質量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠不同時點體質量比較（，g）

表1 各組大鼠不同時點體質量比較（，g）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

給藥6周組別只數造模14 d 360.20±6.49 254.60±8.20**256.80±3.16 260.20±2.30#308.70±6.88##空白組模型組激素組ICA組聯合組10 10 10 10 10 253.20±6.39 204.00±5.46*204.00±6.90 201.80±4.08 199.90±4.86

4.2 淫羊藿苷對模型大鼠24 h尿蛋白含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠造模14 d及給藥6周后24 h-UTP含量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；給藥6周后，與模型組比較，ICA組和聯合組大鼠24 h-UTP含量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠不同時點24 h-UTP含量比較（，mg）

表2 各組大鼠不同時點24 h-UTP含量比較（，mg）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

7.33±0.62 195.30±7.59**193.67±5.09 190.16±3.53#92.52±5.22##空白組模型組激素組ICA組聯合組10 10 10 10 10 4.86±0.50 112.68±3.68**118.74±5.88 119.99±5.65 117.97±6.29

4.3 淫羊藿苷對模型大鼠生化指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清ALB含量減少，SCr、BUN含量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，聯合組大鼠血清ALB含量增加，SCr、BUN含量減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清ALB、SCr、BUN含量比較（）

表3 各組大鼠血清ALB、SCr、BUN含量比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白組模型組激素組ICA組聯合組BUN/（mmol/L）7.55±0.95 14.20±2.10**13.76±1.80 13.66±1.49 6.04±0.86##只數10 10 10 10 10 ALB/（g/L）33.75±2.39 25.94±1.43**27.11±2.34 26.57±1.69 29.34±1.11##SCr/（mmol/L）37.60±3.31 26.30±1.83**28.70±2.16#27.40±2.37 36.78±2.17##

4.4 淫羊藿苷對模型大鼠足細胞形態的影響

空白組大鼠腎小球基底膜完整，系膜基質分布均勻；模型組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，沉積物增多，足細胞腫脹、變性、增生，散在分布于腎小囊內；與模型組比較，各治療組大鼠腎小球基底膜及足細胞病理結構均有不同程度改善，腎小球基底膜沉積物減少，足細胞增生及變性減輕，聯合組改善更佳。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織形態（Masson染色，×400）

4.5 淫羊藿苷對模型大鼠腎組織蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Bcl-2蛋白表達明顯降低，Caspase-3、Bax蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，ICA組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Bcl-2蛋白表達明顯升高，聯合組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Bcl-2蛋白表達明顯升高，Caspase-3、Bax蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達比較（）

表4 各組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組激素組ICA組聯合組Bcl-2 0.84±0.22 0.44±0.08*0.74±0.12 0.86±0.09##1.42±0.18##只數3 3 3 3 3 PODXL 0.94±0.05 0.66±0.06*1.92±0.07##1.02±0.11##1.26±0.15##Ezrin 0.82±0.12 0.44±0.08**0.68±0.03 0.86±0.14##1.10±0.12##Caspase-3 0.62±0.16 1.15±0.14**1.04±0.08 0.94±0.09 0.73±0.12#Bax 0.64±0.11 1.20±0.04**0.88±0.06##1.02±0.10 0.69±0.09##

4.6 淫羊藿苷對模型大鼠腎組織細胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組大鼠腎組織細胞凋亡增加（P＜0.01）；與模型組比較，ICA組和聯合組大鼠腎組織細胞凋亡減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表5、圖3。

圖3 各組大鼠腎組織細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×400）

表5 各組大鼠腎組織細胞凋亡比較（）

表5 各組大鼠腎組織細胞凋亡比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

只數組別空白組模型組激素組ICA組聯合組3 3 3 3 3熒光強度13.95± 7.65 45.35± 9.73**41.96±12.31 29.94±11.52#19.76± 3.06##

5 討論

SRNS是嚴重的進行性腎臟疾病病因之一[12]，絕大多數SRNS患者會發展為慢性腎病和終末期腎病[13]。SRNS病因仍不清楚，也無標準化治療方法，診斷和治療SRNS成為巨大的挑戰[14-15]。腎小球濾過屏障由內皮細胞、腎小球基底膜和足細胞組成，其功能障礙在腎病中普遍發生。有多種調節腎小球濾過屏障功能的蛋白與SRNS相關，包括足細胞狹縫隔膜蛋白、足細胞肌動蛋白、線粒體蛋白、黏附和腎小球基底膜蛋白、轉錄因子等[16]。

PODXL是CD34家族表面糖基化的唾液酸激酶，表達于足細胞和血管內皮細胞表面[17]。成熟的足細胞需要PODXL維持足突結構，其能將足突和狹縫膈膜蛋白定位到正確的膜結構域并維持超濾所需結構的完整性[18]。PODXL可用于識別各種腎小球疾病中的足細胞損傷[19]，是足細胞損傷的特定標志物之一，其表達異常將導致足細胞完整性喪失、腎小球組織破壞[20]和腎臟疾病的發展[21]。Ezrin屬ERM家族成員，為細胞膜和肌動蛋白細胞骨架之間的連接蛋白，主要通過調節黏附分子和信號轉導參與細胞間、細胞與基質間相互作用。Ezrin特異性表達于成熟及發育中的腎小球上皮細胞（GEC），是GEC標志物[22]。Ezrin可與肌動蛋白細胞骨架連接，還可通過Na+/H+-交換調節因子2（NHERF2）與PODXL連接[23]，形成Ezrin-NHERF2-PODXL復合物，該復合物位于足細胞足突頂端，可與肌動蛋白細胞骨架相互作用，這種相互作用在嘌呤霉素氨基核苷、硫酸魚精蛋白或唾液酸酶處理的大鼠GEC中被破壞，表現出顯著的足突消失與腎病綜合征[23]，表明其在維持上皮結構中的重要性[24]。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織PODXL、Ezrin蛋白表達降低，提示足細胞損傷。經ICA聯合激素治療后，模型大鼠腎組織PODXL、Ezrin蛋白表達升高，提示ICA可通過抑制PODXL、Ezrin表達改善腎損傷。

足細胞是腎小球濾過膜的重要組成部分，參與多種腎病的發生發展[25]。足細胞損傷導致蛋白尿和腎病綜合征，進一步誘導足細胞凋亡[26]。因此，減輕足細胞凋亡對治療蛋白尿和進行性腎小球疾病至關重要[27]。Caspase家族是誘導細胞凋亡的關鍵酶，Caspase-3激活后可直接降解細胞內的結構蛋白和功能蛋白，引起細胞凋亡[28]。Bcl-2和Bax通過形成同源或異源二聚體調節細胞凋亡。當受到凋亡信號刺激時，Bax被激活并在線粒體上形成同源二聚體，使線粒體膜通透性增加，引起凋亡因子釋放，最終誘導細胞死亡。凋亡發生伴有細胞色素C從線粒體釋放，繼而伴有Caspase激活和凋亡級聯反應，Bcl-2通過與Bax形成異源二聚體阻止細胞色素C釋放到細胞質，從而抑制細胞凋亡，發揮抗凋亡作用[29]。本研究結果顯示，模型組大鼠腎組織Caspase-3、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，表明腎損傷時凋亡途徑被激活。經ICA聯合激素治療后，模型大鼠Caspase-3、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高。說明ICA能通過抑制足細胞損傷及凋亡改善腎損傷。

綜上所述，ICA可通過上調PODXL、Ezrin、Bcl-2蛋白表達，下調Caspase-3、Bax蛋白表達，抑制足細胞凋亡、恢復細胞結構及完整性，從而減輕SRNS大鼠足細胞損傷。本研究結果初步闡明ICA保護SRNS腎功能，減輕腎損傷的機制。