基于核磁共振的代謝組學技術在腦梗死中的研究進展

2016-08-25 09:45:22夏能志楊運俊溫州醫科大學附屬第一醫院放射科浙江溫州325000

中國現代醫生 2016年17期

關鍵詞：研究

阮　磊　夏能志　楊運俊溫州醫科大學附屬第一醫院放射科，浙江溫州　325000

阮磊夏能志楊運俊▲
溫州醫科大學附屬第一醫院放射科，浙江溫州325000

腦梗死是缺血性腦血管病的嚴重表現形式，其致殘、致死及復發率均較高。近年來隨著神經影像技術的不斷發展，腦梗死的影像學研究正由傳統的大體形態學向功能、分子水平轉變。基于核磁共振的代謝組學技術在腦梗死中的逐漸應用，使得人們對腦梗死的研究深入到細胞代謝水平，對于理解腦梗死的病理生理變化、診斷、預后和療效的判斷均有重要意義。因此，本文基于核磁共振的代謝組學技術在腦梗死研究方面的進展進行綜述。

代謝組學；腦梗死；細胞代謝；核磁共振

［Abstract］Cerebral infarction is a serious form of ischemic cerebrovascular disease and has high disability，mortality and recurrence rate.With the development of neuroimaging techniques in recent years，the imaging study of cerebral infarction is changing from the tradition general morphology to the function and molecular levels.The gradual application of nuclear magnetic resonance（NMR）-based Metabonomics on cerebral infarction makes the study of cerebral infarction deeper into the level of cell metabolism，and has great significance in understanding the pathophysiology，diagnosis，prognosis and curative effect of cerebral infarction.Therefore，this article reviewed the progress of NMR-based Metabonomics on cerebral infarction research.

［Key words］Metabonomics；Cerebral infarction；Cell metabolism；Nuclear magnetic resonance（NMR）

代謝組學（Metabonomics）是指通過定性定量分析生物體系受刺激或擾動后其代謝產物的變化，敘述機體在內外環境變化后代謝過程的動態反應規律，從而研究生物體系代謝途徑的一種技術，是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后發展起來的一門新興組學［1，2］。Nicholson等［1，3］于 1999年首次提出“Metabonomics”的概念，認為代謝組學能檢測、識別和量化整個生物系統而不是單個細胞的代謝變化，并利用NMR在疾病診斷、藥物篩選等方面做了大量的研究工作。隨后，Fiehn等［4］根據研究的對象和目的不同，將對生物體系的代謝產物分析分為4個層次：①代謝物靶標分析；②代謝輪廓分析；③代謝組學分析；④代謝物指紋分析。代謝組學研究的對象大多是相對分子質量為1000以下的小分子代謝物，其在生物醫學的主要分析技術包括核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）和液相色譜-質譜法（LC-MS）。隨著代謝組學技術的不斷發展，代謝組學中生物標志物的研究受到廣泛關注，而基于NMR的代謝組學技術是代謝組學普遍采用的方法［5，6］。

研究表明，我國約有700萬腦卒中患者，且發生率正以每年8.7%的速度上升，每年用于治療腦卒中的費用高達數百億元人民幣，給患者家庭和社會造成沉重的負擔［7-9］。其中缺血性腦卒中約占60%～80%，而腦梗死是其嚴重表現形式［10］。缺血腦組織的損傷機制非常復雜，涉及病理生理、生化、細胞信號轉導等多種改變，近年來隨著神經影像技術的不斷發展，腦梗死的影像學研究正由傳統的大體形態學向功能、分子水平轉變。因此了解缺血腦的組織分子代謝水平的變化規律，對于輔助臨床診斷及判斷疾病預后和治療效果均有非常重要的意義。

1　基于NMR的代謝組學技術

基于NMR的代謝組學技術主要是利用高磁場中原子核對射頻輻射的吸收光譜鑒定體液中化合物結構，通過檢測一系列樣品的NMR譜圖，再結合模式識別方法，對生物體的體液和組織進行系統測量和分析，對完整的生物體中隨時間改變的代謝物進行動態跟蹤檢測、定性定量，然后將這些代謝信息與病理生理過程中的生物學事件關聯起來，可以判斷出生物體的病理生理狀態，并有可能找出與之相關的生物標志物［1，3］。經過幾十年的發展，NMR已成為測定分子結構最有效的工具之一，其可以測定多種核素，如1H、2H、13C、17O、19F、14N、15N、31P、23Na、39K等，其中最常用的核素是1H、13C和31P［11，12］。由于NMR所需樣本用量小、無需分離技術，基于NMR的代謝組學技術已廣泛用于藥物毒理性評定、生物信息學研究、代謝性疾病、腫瘤學等的檢測［13］。近年來，隨著代謝物波譜數據庫的建立和完善，樣品中代謝物的鑒定將變得更加容易。

基于NMR的代謝組學研究中采集得到的是多維的、大量的數據，數據處理一般遵循以下步驟［14］：①NMR譜圖采集，并校正基線和相位；②譜圖預處理，包括歸一化、分段積分和尺度標準化處理；③采用模式識別方法進行聚類分析和生物標志物的識別。主成分分析經過SIMCA軟件處理后，可以得到得分圖和載荷圖兩種分布圖。從得分圖上可觀察樣品的離散、聚集程度，還能反映樣品隨時間的動態變化過程。樣品分布點越集中，說明這些樣品中所含有的變量/分子的組成和濃度越接近，反之則差異越大。在載荷圖中，變量分布與得分圖中的樣品分布和位置相對應，表示所檢測的變量（如NMR中的化學位移）分布情況。然而載荷圖只能粗略尋找差異化合物，若要確定化合物之間差異的顯著性，則須借助相應的統計分析方法。

2　缺血腦組織的代謝物變化

腦梗死發生時會出現腦代謝障礙，造成線粒體有氧代謝中斷、ATP生成減少，從而導致葡萄糖通過無氧酵解產生乳酸（Lactate，Lac）供能，而另一種能量儲存方式的磷酸肌酸亦分解成肌酸（Creatine，Cr）供能［15］。此外，N-乙酰基天冬氨酸（N-acetyl aspartate，NAA）、膽堿（Choline，Cho）、谷氨酸（Glutamate，Glu）、谷氨酰胺（Glutamine，Gln）、γ-氨基丁酸（Gamma-Amino-Butyric Acid，GABA）、丙氨酸（Alanine，Ala）、甘氨酸（Glycine，Gly）、天冬氨酸（Aspartate，Asp）、肌醇（myo-Inositol，m-Ins）、琥珀酸（Succinate，Suc）、牛磺酸（Taurine，Tau）等腦內代謝物均會發生相應變化。通過在體或離體NMR分析腦梗死后代謝物的變化，對研究腦梗死的發病和預后具有重要的醫學價值和社會價值。

2.1NAA

NAA主要存在于成熟的神經元胞體和軸突內，在神經元線粒體或內質網內由天門冬氨酸和乙酰輔酶A合成，是腦內含量僅次于Glu的氨基酸衍生物，通常位于譜圖的2.02 ppm處，是正常人腦MRS中的最高峰。這種高峰信號還包含一小部分其他乙酰混合物信號，比如N-乙酰天門冬氨酰谷氨酸（NAAG）、N-乙酰神經氨酸。NAA反映神經元的密度和活性狀態，可能與神經元的滲透壓調節、軸突-膠質細胞間信號傳遞有關［16，17］。在急性腦梗死患者中，NAA含量降低常被認為是缺血后腦損傷的標志，其降低的水平反映了缺血腦組織損傷的嚴重程度，即降低的程度越大表明丟失的神經元越多［18］。多數研究表明，腦梗死患者梗死核心NAA于超急性期出現輕度下降，急性期顯著下降，慢性期下降達最低水平，標志著腦神經元出現了不可逆性損傷［19］。急性期NAA的降低可能是由于NAA的合成減少和分解增加所致。有臨床試驗表明，NAA下降率為0.67 μg/（kg·h），高于正常成人腦中NAA的合成速率0.55 μg/（kg·h）［20］。同時，由于NAA的合成是ATP依賴性的，能量的缺乏會使NAA持續降低。Munoz等［21］對51例急性腦缺血患者進行1H-MRS檢查發現，缺血區和缺血周圍組織的NAA進行性下降，表明神經損傷從缺血發生后到2周甚至更長時間可持續存在。Lei等［22］對缺血30 min后再灌注小鼠的研究發現，缺血側紋狀體的NAA含量在缺血后3 h顯著降低，且缺血24 h仍然顯著減少。

有研究顯示，NAA與梗死面積及臨床預后相關，一般大面積梗死患者NAA降低程度較小面積梗死者更嚴重，而NAA的恢復或升高可能預示好的預后［23，24］。Brulatout等［25］利用在體NMR對全腦缺血30 min后再灌注大鼠的研究發現，NAA先呈顯著降低，恢復灌注后再逐漸恢復。NAA降低程度通常較Cho和Cr更大，可能是因為腦梗死區神經元較膠質細胞對缺血更敏感，當神經元功能受損時，膠質細胞結構尚完整［26］。

2.2Lac

Lac是無氧糖酵解的產物，被認為是腦梗死開始階段最敏感的標志物［6，27］。當譜圖中出現Lac峰時，常提示腦組織存在缺血、缺氧，腦細胞有氧代謝障礙而無氧糖酵解加強。腦缺血剛發作時Lac含量最高，其反映存活神經元的代謝紊亂而非神經元的壞死情況［24］。腦缺血后Lac含量的升高可分為兩個階段：第一個階段是腦組織缺血缺氧后的無氧酵解，第二個階段于再灌注后1 h開始增加并可持續到再灌注72 h。后者Lac含量的升高可能是由于膠質細胞Lac代謝的增加所致［28］。腦梗死后Lac可從急性期到慢性期持續升高，可作為慢性腦缺血的標記。Lac的持續升高可能是因為Lac隨梗死區細胞的溶解而緩慢擴散，或由缺血半暗帶神經元及滲入的炎性細胞產生。Lac的升高程度與缺血程度和血液中葡萄糖濃度有關。有研究表明，低血糖能阻止大鼠腦缺血再灌注導致的乳酸增加，可能是低血糖能減少缺血后代謝的負擔，而且低血糖對缺血后游離脂肪酸和興奮性氨基酸水平的影響較小［29］。Lac在缺血數天后會被清除，而其持續升高也可能源于其合成和清除的失衡［30］。然而，這種持續性升高并非絕對的。Gideon等［31］利用MRS對腦梗死患者的長期隨訪發現，Lac可以在腦缺血后1～4周降低，而在7～15個月的慢性期又重新出現。

急性期Lac含量升高和NAA水平降低可反映梗死核心的形成。Henriksen等［32］研究急性期Lac和相對腦血流量的關系發現，兩者成反向關系，且Lac在缺血區分布不均，梗死核心Lac比梗死周圍區含量高。研究表明，NAA與Lac的綜合分析對于區別梗死核心與腦缺血半暗帶有重要的價值，NAA顯著降低、Lac明顯升高的區域可能為不可逆損傷區，而Lac顯著升高、NAA正常或輕度下降的區域可能為腦缺血半暗帶［33］。

2.3Cho和Cr

既往臨床研究常以Cho和Cr作為參照物，來計算NAA和Lac的相對濃度，其認為腦梗死患者Cho和Cr的濃度不會發生顯著變化［34，35］。但近年來國內外多數研究表明，Cho和Cr在腦梗死時并不是恒定不變的，不同腦梗死時期其濃度不同。有研究發現，Cr在腦梗死后3個月持續降低，而Cho在腦梗死后2周明顯降低，隨后逐漸上升至正常水平［36］。Cho主要存在于細胞膜，是細胞膜和鞘磷脂的標志物。譜圖上Cho峰由磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿、游離膽堿構成，其峰值高低取決于膜磷脂和神經遞質乙酰膽堿的濃度。Cho濃度升高表明細胞膜合成增加或細胞數量增加，降低則表明細胞膜的破壞［37］。

譜圖上的Cr峰由肌酸和磷酸肌酸共同構成，其存在于神經元和膠質細胞中，是細胞內磷酸轉運系統和能量緩沖系統的標志物［38］。作為一種能量儲備形式，Cr在ATP不足時參與機體供能，對于維持細胞能量代謝起著重要作用。Cr在缺血24 h后開始降低，可持續降低到缺血后96 h［18］，提示超急性期由于腦缺血而出現明顯的能量代謝障礙，從而導致高能磷酸代謝物減少，說明神經元對缺血的反應非常敏感。研究表明，腦梗死超急性期Cr開始顯著下降，隨著梗死時間延長，急性期至亞急性期Cr逐步降低，至慢性期降到較低水平。腦梗死患者Cr與NAA下降趨勢基本保持一致，但Cr下降程度不及NAA明顯［39］。有研究表明，NAA/Cr和Cho/Cr可反映缺血性腦白質損傷患者的認知功能障礙情況，重度認知障礙患者NAA/Cr和Cho/Cr降低，而對輕中度認知障礙患者，NAA/Cr降低而Cho/Cr明顯增加［40］。

2.4Glu、Gln和GABA

Glu、Asp是興奮性氨基酸，對神經元有興奮作用，然而其濃度過高則可產生神經毒性作用；GABA和Gly是抑制性氨基酸，能抑制神經興奮，在一定程度上可抵消興奮性神經毒性作用［41，42］。通常情況下，機體中興奮性氨基酸和抑制性氨基酸處于一個動態平衡之中［43］。有研究表明，神經元和神經膠質細胞間存在Gln-Glu-GABA循環，即神經元釋放至胞外的Glu可被神經膠質細胞吸收，在谷氨酰胺合成酶的作用下轉化成Gln，然后神經膠質細胞中的Gln被轉運至神經元中被谷氨酰胺酶水解成Glu，此外在GABA能神經元中，Glu在谷氨酸脫羧酶的作用下形成GABA。Glu雖然是腦內最重要的興奮性神經遞質，但是體內合成的谷氨酸卻不能通過血腦屏幕，所以只能通過Gln-Glu途徑產生的Glu才能作為神經遞質發揮作用。

在缺血條件下Glu含量急劇升高，致使神經元上非N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體活化、鈉離子通道開放，造成大量鈉離子內流，引起細胞腫脹［44］。同時過量的Glu還可活化NMDA受體，促使鈣通道開放，鈣離子大量內流造成鈣超載，神經細胞嚴重受損，甚至死亡。腦內谷氨酸興奮性神經毒性是腦缺血性損傷的主要因素，而且缺血改變了星形膠質細胞與神經元間Gln-Glu循環，梗死核心的膠質細胞由于缺氧而不能將細胞外積累的Glu轉化為Gln，抑制了星形膠質細胞對Glu的吸收，導致Glu濃度進一步升高［45］。有實驗研究表明，Glu在缺血后2 h含量達到最高，MRS聯合ADC、DWI可通過定量分析代謝物的濃度評估超急性期腦缺血發作時間［46］。

2.5其他

m-Ins普遍存在于膠質細胞中，對維持細胞內外環境滲透壓的穩定起重要作用，是膠質細胞功能受損的敏感標志物［6］。Tau也主要存在于膠質細胞中，是一種重要的抑制性神經遞質，有保護和調節神經的作用，可以促進神經元增殖和分化［42］。Suc是三羧酸循環中的重要物質，同時參與Glu-GABA-Suc代謝旁路，即除了參與能量代謝循環外，還參與Glu及GABA的平衡［47］。Ala是體內非必需氨基酸，存在諸多代謝途徑，在酶的催化下可轉變為丙酮酸參與糖酵解，且與Glu互為可逆反應。

腦缺血可導致三羧酸循環、糖酵解、氨基酸、磷脂和核苷酸代謝等代謝變化，基于NMR的代謝組學技術已成為分析腦缺血代謝物變化的有力檢查手段。通過1H-MRS檢測腦缺血各階段的代謝標記物的變化對腦梗死的診斷、治療和預后具有重要的指導意義。

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