枯草芽孢桿菌B91產芽孢發酵條件優化

陳靜宇，李　晶，2，張淑梅，2，孟利強，2

（1.黑龍江省科學院微生物研究所黑龍江省生物工程重點實驗室，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱 150020）

枯草芽孢桿菌B91產芽孢發酵條件優化

陳靜宇1，李晶1，2，張淑梅1，2，孟利強1，2

（1.黑龍江省科學院微生物研究所黑龍江省生物工程重點實驗室，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱 150020）

在三角瓶培養條件下，采用單因素實驗對枯草芽孢桿菌B91發酵條件裝液量、起始pH值及溫度進行了優化。在此基礎上進行了響應面分析，獲得了響應面回歸模型，模型擬合良好，確定了菌株B91最佳的產孢發酵條件為裝液量44.7 mL、初始pH 8.3、溫度31.5℃。在最優條件下發酵培養，芽孢濃度為44.89億±0.29億/mL，較優化前提高了36.4%。

枯草芽孢桿菌；芽孢；響應面；發酵條件；優化

枯草芽孢桿菌是目前研究最為深入的一種芽孢桿菌，它能產生多種抗菌物質，現已廣泛應用于醫藥工業、畜牧業及植物病害防治等領域［1］。且多數菌株對人類和環境都具有很好的安全性，所以近年來枯草芽孢桿菌成為食物病害防治領域的研究熱點，國內外已有較多報道［2］。而枯草芽孢桿菌活菌制劑的活菌數量是其制劑穩定性的重要保障，所以微生態制劑中活菌數的降低直接影響其使用效果，這一問題可以通過提高活菌制劑中的芽孢比例得以緩解［3］。通過調控發酵條件提高發酵液中芽孢的比例，芽孢具有較好的抗逆性，可以抵抗外界的環境壓力，可以提高活菌制劑的穩定性，保證其使用效果［4］。

本研究所用菌株枯草芽孢桿菌B91是本實驗室的自有菌株，能夠抑制多種植物病原菌，具有較好的田間防效，具有廣泛的應用前景。本文對其發酵條件進行優化，提高其發酵液中菌體密度及芽孢形成率，為下一步擴大生產打下基礎。

1　材料與方法

1.1實驗菌種

枯草芽孢桿菌B91菌株由本實驗室提供。

1.2發酵培養基

葡萄糖9.4 g/L，酵母膏6.9 g/L，氯化鈉3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO410.2 mg/L，CaCO30.2 g/L，培養基采用濕熱滅菌：121℃，15 min。

1.3培養方法

1.3.1種子活化及培養

種子活化及培養參照文獻［5］。

1.3.2發酵培養

接種量均為1%，250mL的三角瓶裝液量為50 mL，搖床轉速為150 rpm，30℃下培養48 h。

1.4芽孢計數

沸水浴處理待測樣品20 min，滅活未形成芽孢的營養體，冷卻后采用菌落計數法計數測得樣品芽孢數［6］。

1.5單因素實驗

選擇裝液量、發酵液初始pH值、發酵溫度作為主要優化因素，裝液量分別設為30 mL、50 mL、70 mL、90 mL，發酵pH值分別設為5、6、7、8、9，發酵溫度分別設為28℃、31℃、34℃、37℃、40℃。

1.6響應面分析

采用Box-Behnken設計，在搖瓶發酵條件下優化三個發酵條件：裝液量、pH、溫度，設計3因素3水平的響應面分析試驗（表1）。

表1　Box-Behnken設計因子代碼與水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1裝液量對芽孢數量的影響

圖1　裝液量對芽孢數量的影響Fig.1 Effects of volume loading on the concentration of spores

在搖瓶發酵過程中，裝液量直接關系發酵液的溶氧系數，裝液量越少溶氧越高，反之亦然。如圖1所示，搖瓶的裝液量對芽孢形成數量影響顯著（P＜0.05），裝液量為50 mL/250mL時芽孢數量最多，達到40.9億/mL，當裝液量繼續增加時，由于溶氧降低，抑制了芽孢的形成，所以芽孢形成數量減少。

2.1.2初始pH對芽孢數量的影響

圖2　初始pH對芽孢數量的影響Fig.2 Effects of initial pH on the concentration of spores

如圖2所示，發酵初始pH值對芽孢形成的影響變化趨勢，當發酵初始pH值在5～7，芽孢形成數量迅速增加，而當發酵初始pH值為8時芽孢數量達到最大42.1億/mL，隨著發酵初始pH值繼續增加，芽孢數量呈逐漸下降趨勢，所以初始pH 8設為響應面試驗中心試驗點。

2.1.3發酵溫度對芽孢數量的影響

圖3　發酵溫度對芽孢數量的影響Fig.3 Effects of temperature on the concentration of spores

發酵溫度影響菌體的生長繁殖，如圖3所示，發酵溫度31℃時芽孢形成數量最多，為43.5億/mL，隨著發酵溫度的升高芽孢數量呈下降趨勢，所以選擇發酵溫度30℃進行響應面實驗。

2.2響應面法優化發酵條件

響應面試驗結果見表2，經過多元回歸擬合，獲得的芽孢數 （Y）對X1、X2和X3三個自變量的三元二次回歸模型方程：Y=44.54-3.1375A-0.125B+1.2375C -2.625AB-1.7AC+1.625BC-6.17A2-1.595 B2-6.82 C2。利用軟件Design Expert 8.0進行求導，解出極值點，算出每個因素的最佳值：裝液量為44.74 mL、初始pH為8.34、溫度為31.52℃，此時模型的理論最優芽孢濃度為45.18億/mL。

表2　響應面試驗設計與結果Tab.2 Response surface design and results

表3為回歸模型方差分析結果，由結果可知模型是顯著的 （P≤0.0001），并且決定系數為0.9832，說明該模型是準確可靠的，因此，可用此模型對枯草芽孢桿菌B91的發酵條件進行分析和預測［6，7］。

表3　響應面試驗設回歸分析Tab.3 Analysis of variance of response surface design

以回歸方程為基礎，采用軟件分析繪制兩兩因素間相應的響應面分析圖（圖4～6），響應曲面的極值點是兩個因素交互的最大值，根據響應面分析結果，枯草芽孢桿菌B91菌株芽孢濃度最優極值點為裝液量為44.7 mL、初始pH為8.3、溫度為31.5℃，預測最優值為45.18億/mL。

圖4　裝液量和pH交互作用對芽孢數影響Fig.4　Response surface plot of spores concentration versus volume loading and pH

圖5　裝液量和溫度交互作用對芽孢數影響Fig.5　Response surface plot of spores concentration versus volume loading and temperature

圖6　pH和溫度互作用對芽孢數影響Fig.6　Response surface plot of spores concentration versus pH and temperature

3　討論與結論

培養條件對于細菌的繁殖，尤其是芽孢的產生尤為重要，在單因素實驗中發現最適合B91菌株搖瓶發酵的條件為裝液量50 mL/250mL，初始pH值8，發酵溫度30℃，在此基礎上發酵48h芽孢形成較好為43.5 億/mL。在上述條件基礎上設計了響應面實驗，響應回歸模型的決定系數為0.9832，說明該模型擬合程度良好，最優培養條件為裝液量44.74 mL、初始pH 8.34、溫度31.52℃。在最優條件下發酵培養，芽孢濃度為44.89億±0.29億/mL與模型的理論最優芽孢濃度為45.18億/mL相近，說明該模型擬合的有效性。

［1］ 趙朋超，王建華，權春善，等.枯草芽孢桿菌抗菌肽生物合成的研究進展［J］.中國生物工程雜志，2010，30（10）：108-113.

［2］ 張彩鳳.生防菌枯草芽孢桿菌的研究進展［J］.現代農村科技，2015，（21）：47-47.

［3］甄靜，郭直岳，謝寶恩，等.枯草芽孢桿菌XK-1產芽孢條件的優化［J］.中國農學通報，2012，28（27）：146-151.

［4］ 郭夏麗，狄源寧，王巖，等.枯草芽孢桿菌產芽孢條件的優化［J］.中國土壤與肥料，2012，（03）：99-103.

［5］ 孟利強，趙曉宇，陳靜宇，等.響應面法優化枯草芽孢桿菌B91發酵培養基［J］.安徽農業科學，2015，（25）：26-29.

［6］ 陳琳，孟祥晨.響應面法優化植物乳桿菌代謝產細菌素的發酵條件［J］.食品科學，2011，32，（3）：176-180.

［7］ 王西祥，丁延芹，杜秉海，等.響應面法優化枯草芽孢桿菌NS178產芽孢發酵工藝［J］.山東農業科學，2015，（04）：59-65.

Optimization of spore production in fermentation conditions aboutBacillus subtilisB91

CHEN Jing-yu1，LI Jing1，2，ZHANG Shu-mei1，2，MENG Li-qiang1，2
（1.Heilongjiang Key Laboratory of Biotechnology，Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，China）

Under the condition of cultivation in the flask，by using single-factor experiment，Bacillus subtilisB19's liquid medium volume，initial PH and fermentation temperature were optimized.On the basis of response surface analysis，the response-surface model was obtained and model fitting did well.The optimum spore production and fermentation conditions ofBacillus subtilisB19 were determined.Finally it finds out that liquid volume is 44.7 mL，initial PH is 8.3 and fermentation temperature is at 31.5℃.Under the condition of the optimal fermentation cultivation，spore concentration is 44.89billion±0.29 billion/mL，which is increased by 36.4%before optimization.

Bacillus subtilis；Spore；Response surface；Fermentation condition；Optimization

Q781

A

1674-8646（2016）12-0001-04

2016-05-17

黑龍江省科學學部委員指導專項（2014HK013）

陳靜宇（1980-），男，黑龍江哈爾濱人，學士，實驗師，從事農業微生物研究。

孟利強（1983-），男，內蒙古呼和浩特人，碩士，副研究員，從事農業微生物、分子生物學研究，e-mail：mengliqiang83420@163.com。