大體積進(jìn)樣-非勻強(qiáng)電場(chǎng)掃集微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜法測(cè)定化妝品中糖皮質(zhì)激素

郭成方，商少明，劉俊康，沈　潔，孫雪婷，何勝俊

(江南大學(xué)　化學(xué)與材料工程學(xué)院　食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇　無(wú)錫　214122)

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大體積進(jìn)樣-非勻強(qiáng)電場(chǎng)掃集微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜法測(cè)定化妝品中糖皮質(zhì)激素

郭成方，商少明*，劉俊康，沈潔，孫雪婷，何勝俊

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

建立了一個(gè)簡(jiǎn)單有效的微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜(MEEKC)在線(xiàn)富集-大體積進(jìn)樣(LVSI)與非勻強(qiáng)電場(chǎng)掃集(REFS)聯(lián)用測(cè)定化妝品中4種糖皮質(zhì)激素(潑尼松、氫化可的松、潑尼松龍和倍他米松)的方法。MEEKC的緩沖體系組成為:2.4%SDS,0.6%正辛烷,6.6%正丁醇,30 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.2)，分離電壓為9.6 kV，進(jìn)樣壓力為12.3 kPa，進(jìn)樣時(shí)間為95 s，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，4種糖皮質(zhì)激素的富集倍數(shù)為853～933倍，在0.015～14 mg/L范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，檢出限(S/N=3)為4～8 μg/L。應(yīng)用此方法分析了化妝品樣品,回收率為93.7%～103.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)均不大于4.4%。

微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜；在線(xiàn)富集；大體積進(jìn)樣；掃集；化妝品；糖皮質(zhì)激素

糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids)是一類(lèi)由腎上腺皮質(zhì)分泌的甾類(lèi)激素，潑尼松(PS)、氫化可的松(HC)、潑尼松龍(PL)和倍他米松(BT)是腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，具有重要的生理活性，如抗炎及抗過(guò)敏，降低毛細(xì)血管壁和細(xì)胞膜的通透性，減少炎性滲出等作用。化妝品中加入糖皮質(zhì)激素可起到美白保濕的效果,但長(zhǎng)期使用含有糖皮質(zhì)激素的化妝品會(huì)產(chǎn)生面部毛囊萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張等副作用[1]，對(duì)人體面部皮膚造成嚴(yán)重?fù)p害。我國(guó)《化妝品規(guī)范》[2]中明確規(guī)定糖皮質(zhì)激素為化妝品中禁用組分。因此，建立化妝品中糖皮質(zhì)激素的經(jīng)濟(jì)、快速和高靈敏的檢測(cè)方法對(duì)于化妝品的質(zhì)量控制，確保化妝品的使用安全具有重要意義。

糖皮質(zhì)激素的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3-5]、固相萃取/液相色譜法(SPE/HPLC)[6-7]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[8-9]和毛細(xì)管電泳法(CE)[10-12]等。相比之下，CE法具有快速、高效、耗樣量少等特點(diǎn)。CE通常使用紫外檢測(cè)器，為了減小譜帶擴(kuò)張,紫外檢測(cè)主要采用柱上檢測(cè)的方法,然而，由于毛細(xì)管內(nèi)徑較小，紫外檢測(cè)的靈敏度受到很大限制。因此，對(duì)于化妝品中微量和痕量糖皮質(zhì)激素檢測(cè)，傳統(tǒng)的CE法很難滿(mǎn)足要求。目前,通過(guò)在線(xiàn)富集技術(shù)提高靈敏度的方法已頗受重視，該技術(shù)可通過(guò)對(duì)樣品、運(yùn)行緩沖液的組成以及進(jìn)樣程序進(jìn)行簡(jiǎn)單的調(diào)控提高靈敏度，無(wú)需對(duì)商品儀器進(jìn)行改造，而且富集效果好。

微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜(MEEKC)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種電泳新技術(shù)[13]，該技術(shù)一般采用水包油型微乳液作為分離介質(zhì)，對(duì)中性物質(zhì)具有良好的分離效果。但MEEKC在線(xiàn)富集的方法報(bào)道較少[14-16]。本研究建立了大體積進(jìn)樣-非勻強(qiáng)電場(chǎng)掃集微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜法(LVSI-REFS/MEEKC)同時(shí)檢測(cè)化妝品中4種糖皮質(zhì)激素的方法，與常規(guī)CE相比，方法靈敏度提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。本方法操作簡(jiǎn)單、樣品用量少、分析快速，具有良好的分離度和靈敏度。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

TH-3100型高效毛細(xì)管電泳儀(保定天惠分離科學(xué)研究所)，配紫外檢測(cè)器和溫控裝置；未涂層毛細(xì)管(河北永年瑞灃光導(dǎo)纖維廠(chǎng)，65 cm×50 μm，有效長(zhǎng)度50 cm)；分析天平、EF20 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；SK2200H 超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；Milli-Q Refrence 超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪高科儀器廠(chǎng))；DDS-307電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

潑尼松(PS)、氫化可的松(HC)、潑尼松龍(PL)、倍他米松(BT)標(biāo)準(zhǔn)品(上海安譜科學(xué)儀器公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)、硼砂、HBO3、NaH2PO4、NaOH、正丁醇、正辛烷、甲醇(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。化妝品樣品購(gòu)于本地超市。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2溶液的制備

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取PS，HC，PL，BT標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成2 mg/mL的儲(chǔ)備液，避光4 ℃保存。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2樣品溶液制備準(zhǔn)確稱(chēng)取化妝品樣品1.0 g于50 mL離心管內(nèi)，向其中加入15 mL甲醇,充分振蕩5 min,超聲20 min,再加入10 mL正己烷,振蕩10 min,以8 000 r/min離心8 min,棄去上層正己烷層；再加入10 mL正己烷重復(fù)上述操作，下層甲醇溶液在45 ℃下減壓濃縮至約1 mL。以樣品基質(zhì)溶液定容至10 mL，即得樣品溶液。

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1電泳條件緩沖體系：2.4% SDS,0.6% 正辛烷,6.6% 正丁醇，30 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.2)；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；環(huán)境溫度20 ℃。

1.3.2LVSI-REFS/MEEKC條件分離電壓為9.6 kV，采用壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力12.3 kPa，進(jìn)樣時(shí)間95 s。

1.3.3毛細(xì)管沖洗方法在實(shí)驗(yàn)前，依次用0.1 mol/L鹽酸溶液、超純水、1 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水、運(yùn)行緩沖溶液沖洗10 min。兩次樣品分析運(yùn)行期間，分別用1 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水、運(yùn)行緩沖溶液沖洗5 min，以獲得良好的分離檢測(cè)重現(xiàn)性。

1.4LVSI-REFS/MEEKC的分離富集模式

LVSI-REFS/MEEKC的分離過(guò)程見(jiàn)圖1。樣品溶液中不含微乳粒子但電導(dǎo)率高于運(yùn)行緩沖液(BGS)。毛細(xì)管中先充滿(mǎn)含有微乳粒子的運(yùn)行緩沖液，然后在入口端以壓力進(jìn)樣方式引入一段樣品溶液(圖1A)。施加正電壓后(毛細(xì)管兩端插入BGS中),運(yùn)行緩沖液中帶負(fù)電荷的微乳粒子從陰極端向陽(yáng)極端遷移,在運(yùn)行緩沖液和樣品界面上發(fā)生微乳堆積(圖1B)。堆積的微乳粒子穿過(guò)樣品區(qū)帶并將分析物掃集到一個(gè)較窄的區(qū)域(圖1C)。由于電滲流(EOF)的速度大于帶負(fù)電微乳粒子的淌度(μ)，被掃集的樣品區(qū)帶在EOF的作用下向陰極移動(dòng)，富集后的分析物以MEEKC模式進(jìn)行分離(圖1D)。

2　結(jié)果與討論

2.1運(yùn)行緩沖液與樣品溶液電導(dǎo)率差異的影響

運(yùn)行緩沖液和樣品溶液的電導(dǎo)率差異對(duì)富集效率影響很大。分別考察了運(yùn)行緩沖液(pH 8.2)和樣品溶液(pH 3.6)電導(dǎo)率差異對(duì)富集效果的影響(見(jiàn)表1)。由表可知，運(yùn)行緩沖液的電導(dǎo)率低于樣品溶液的電導(dǎo)率時(shí)，4種激素的富集效果較好。這是由于毛細(xì)管兩端施加相同的電壓，運(yùn)行緩沖液的電導(dǎo)率低，電場(chǎng)強(qiáng)度大，帶電的微乳粒子在運(yùn)行緩沖液中遷移速率較快，遇到低電場(chǎng)強(qiáng)度的樣品區(qū)帶，微乳粒子在接界處堆積進(jìn)而抵擋了掃集后堆積樣品區(qū)帶的展寬，從而實(shí)現(xiàn)了較好的富集效果。

表1　運(yùn)行緩沖溶液和樣品溶液電導(dǎo)率差異的影響

2.2SDS濃度的影響

SDS濃度是影響MEEKC分離和富集的重要因素。考察了SDS濃度分別為1.2%，1.8%，2.4%，3.0%，5.4%時(shí)對(duì)分離富集效果的影響。結(jié)果顯示，在較低的SDS濃度(1.2%)下，分析物的分離度和富集效果較差，隨著SDS濃度的增加，分析物的保留時(shí)間延長(zhǎng)，分離度明顯改善，峰高增加，SDS濃度為2.4% 時(shí)峰高達(dá)到最大值。隨著SDS濃度繼續(xù)增加，電流增大，產(chǎn)生的焦耳熱增多，導(dǎo)致峰高逐漸降低。且在SDS濃度為5.4%時(shí)，基線(xiàn)不平穩(wěn)。綜合考慮，選擇SDS的最佳濃度為2.4%。

2.3運(yùn)行緩沖液的pH值與濃度的影響

運(yùn)行緩沖液的pH值對(duì)富集效果和分析時(shí)間影響很大。考察了運(yùn)行緩沖液的pH值在7.4～9.0范圍內(nèi)對(duì)富集效果的影響(圖2)。結(jié)果表明，隨著pH值的增加，分析時(shí)間逐漸減少，這是由于pH值的升高引起電滲流增加所致。此外，當(dāng)pH值小于8.2時(shí),隨著pH值的提高,峰高增加，峰形明顯改善，當(dāng)pH值大于8.2時(shí)，峰高開(kāi)始降低，并伴有峰展寬。考慮到分析時(shí)間和富集效果，實(shí)驗(yàn)選擇pH 8.2為最優(yōu)值。

同時(shí)考察了pH 8.2時(shí)不同運(yùn)行緩沖液的濃度(5，10，20，30，40 mmol/L)對(duì)富集效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硼酸鹽緩沖溶液的濃度越低，分離時(shí)間越短，但富集效果差；硼酸鹽緩沖溶液濃度越高，分離時(shí)間越長(zhǎng),但峰高減小。當(dāng)硼酸鹽緩沖溶液濃度為30 mmol/L(pH 8.2)時(shí)，在25 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)4種激素的基線(xiàn)分離，且富集效果最好。因此，確定硼酸鹽緩沖溶液的最佳濃度為30 mmol/L。

2.4樣品基質(zhì)溶液濃度的影響

將樣品分別溶解在40～80 mmol/L(pH 3.6)的磷酸鹽緩沖溶液中，考察了樣品基質(zhì)溶液濃度對(duì)富集效果的影響。結(jié)果表明，樣品基質(zhì)溶液濃度為60 mmol/L時(shí)，富集效果最好，隨著濃度的降低，分析時(shí)間減少，富集效果逐漸變差，這是因?yàn)闃悠坊|(zhì)溶液濃度降低，樣品區(qū)帶的電導(dǎo)率和運(yùn)行緩沖液的電導(dǎo)率逐漸接近，整個(gè)毛細(xì)管內(nèi)形成勻強(qiáng)電場(chǎng)，微乳粒子在樣品區(qū)帶和運(yùn)行緩沖液接界處無(wú)法堆積，影響了富集效率。當(dāng)濃度高于60 mmol/L時(shí)，隨著濃度的增加，較高的電導(dǎo)率會(huì)使樣品區(qū)帶的電場(chǎng)強(qiáng)度隨之增加，而較高的場(chǎng)強(qiáng)使樣品區(qū)帶壓縮速度減慢并發(fā)生解聚，分析時(shí)間延長(zhǎng)，富集效率降低。綜合考慮，樣品基質(zhì)溶液濃度選擇60 mmol/L。

2.5進(jìn)樣時(shí)間的選擇

固定進(jìn)樣壓力為12.3 kPa，考察了進(jìn)樣時(shí)間分別為70,80,90,95,100，110 s時(shí)對(duì)峰高的影響。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)，峰高明顯增加。但進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)95 s時(shí)，由于進(jìn)樣量過(guò)大導(dǎo)致毛細(xì)管過(guò)載，出現(xiàn)明顯的峰展寬現(xiàn)象，峰高下降。因此選擇最佳進(jìn)樣時(shí)間為95 s。

2.6富集倍數(shù)

在優(yōu)化條件下，分別采用常規(guī)MEEKC和LVSI-REFS/MEEKC方法測(cè)得4種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品的峰高(圖3)，分別表示為h和H，樣品濃度分別為200，2 μg/mL，則富集倍數(shù)fi=(Hi/hi)×(200/2)，由此公式計(jì)算出PS，HC，PL，BT的富集倍數(shù)分別為853，893，933和925倍。

2.7線(xiàn)性關(guān)系與檢出限

配制4種糖皮質(zhì)激素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)化條件下進(jìn)行分離分析，以峰高(y)對(duì)樣品濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得4種分析物的檢出限(LOD)，結(jié)果見(jiàn)表2。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，4種糖皮質(zhì)激素在0.015～14 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其LODs(S/N=3)達(dá)4～8 μg/L。

表2　4種激素的線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

表3列舉了本方法與其他方法的比較。 HPLC/UV雖然方法穩(wěn)定，但需消耗大量溶劑，且靈敏度較低;LC-MS具有較高的靈敏度，但儀器價(jià)格較為昂貴，且受化妝品樣品基質(zhì)影響較為嚴(yán)重;SPE/HPLC也具有較低的檢出限，但需對(duì)樣品進(jìn)行凈化前處理和離線(xiàn)預(yù)富集，操作繁瑣;CE-UV高效快速，但靈敏度較低。而LVSI-REFS/MEEKC采用在線(xiàn)富集技術(shù)，樣品前處理簡(jiǎn)單，且靈敏度較高，更適合化妝品中微量或痕量激素的檢測(cè)。

表3　LVSI-REFS/MEEKC檢測(cè)糖皮質(zhì)激素和其他方法的對(duì)比

CS：cortisone;DS：dexamethasone；ACS：acetate-cortisone;BFS：fluticasone propionate;FS：flumethasone;TD：triamcinolone acetonide;BS：budesonide;TAD：triamcinolone acetonide

2.8回收率與精密度

平行稱(chēng)取經(jīng)測(cè)定不含激素的化妝品試樣2份，其中1份測(cè)定其本底值，另1份加入8 μg/L的4種激素混合物，經(jīng)乳化機(jī)高速剪切，充分混勻后，按照本方法進(jìn)行分析測(cè)定，其結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，如果化妝品中4種激素的含量在8 μg/L以上，使用該方法均能檢出。另稱(chēng)取上述試樣5 g，平行5份，分別加入一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后，按照本方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，4種激素的平均回收率為93.7%～103.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于4.4%。

2.9實(shí)際樣品的測(cè)定

選擇洗面奶、爽膚水、潤(rùn)膚霜、沐浴露、洗發(fā)水、護(hù)發(fā)素、粉底液、乳液等11種不同形態(tài)的市售及美容院專(zhuān)用化妝品，在優(yōu)化條件下進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果表明，所選化妝品樣品均未檢出4種分析物。

3　結(jié)　論

建立了可同時(shí)測(cè)定化妝品中4種糖皮質(zhì)激素的微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜-大體積進(jìn)樣與非勻強(qiáng)電場(chǎng)掃集聯(lián)用方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好；通過(guò)在線(xiàn)大體積進(jìn)樣與非勻強(qiáng)電場(chǎng)掃集聯(lián)用技術(shù)對(duì)化妝品中的痕量糖皮質(zhì)激素進(jìn)行富集，提高了分析的靈敏度，為化妝品中痕量糖皮質(zhì)激素的分離測(cè)定提供了一種新方法。

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Online Determination of Glucocorticoids in Cosmetics by Large Volume Sample Injection-Reduced Electric Field Sweeping and Microemulsion Electrokinetic Chromatography

GUO Cheng-fang,SHANG Shao-ming*,LIU Jun-kang,SHEN Jie,SUN Xue-ting,HE Sheng-jun

(School of Chemical and Material Engineering，The Ministry of Education Key Laboratory of Food Colloid and Biological Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

A simple and efficient online sample pre-concentration method composed of large volume sample injection(LVSI)-reduced electric field sweeping(REFS) and microemulsion electrokinetic chromatography(MEEKC) was developed for the determination of glucocorticoids(prednisone,hydrocortisone,prednisolone and betamethasone) in cosmetics.The microemulsion background buffer was composed of 2.4%dodecyl sodium sulfate,6.6% butanol,0.6%octane and 30 mmol/L borate buffer(pH 8.2).The separation voltage was 9.6 kV and the sample was injected at 12.3 kPa for 95 s.The detection wavelength was set at 230 nm.Under the optimum conditions，the enrichment factors ranged from 853 to 933.The calibration curves were linear in the concentration of 0.015-14 mg/L.The limits of detection(S/N=3) were in the range of 4-8 μg/L.The developed method was used to analyze corticosteroids in cosmetics with recoveries of 93.7%-103.8%and RSDs(n=5) not more than 4.4%.

microemulsion electrokinetic chromatography；online pre-concentration；large volume sample injection；sweeping；cosmetic；glucocorticoid

2015-10-19；

2016-01-13

國(guó)家質(zhì)量檢驗(yàn)檢疫監(jiān)督總局項(xiàng)目(2010IK183)

商少明，博士，副教授，研究方向：光譜分析與分離分析，Tel：0510-85917090，E-mail:smshang@jiangnan.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.009

O657.3;O625.312

A

1004-4957(2016)06-0686-06

研究簡(jiǎn)報(bào)