基于金銀納米立方體構建高靈敏CA-153傳感器的研究

賈翠娟，張思寶，杜璋璋

(1.濟寧職業技術學院　生物與化學工程系,山東　濟寧　272037；2.山東化工研究院，山東　濟南　250014)

?

基于金銀納米立方體構建高靈敏CA-153傳感器的研究

賈翠娟1*，張思寶2，杜璋璋1

(1.濟寧職業技術學院生物與化學工程系,山東濟寧272037；2.山東化工研究院，山東濟南250014)

癌抗原-153(CA-153)是乳腺癌最重要的特異性標志物。利用CA-153與其抗體之間的特異性識別性構建“三明治”夾心結構的免疫傳感器，在玻碳電極上修飾金納米/氧化石墨烯復合材料，通過納米金和CA-153抗體之間的吸附作用，將抗體固定于電極表面，以牛血清白蛋白封閉非特異性吸附位點。金銀(AuAg)納米立方體標記CA-153二抗，標記的AuAg納米立方體催化過氧化氫氧化電子媒介體硫堇，采用差分脈沖伏安法檢測CA-153的電化學信號。在最優條件下，此傳感器的響應電流與CA-153濃度的對數在2.0×10-5～100 U/mL范圍內呈良好的線性關系，檢出限(S/N=3)為7.0×10-6U/mL。對實際血清樣品進行加標回收實驗，回收率為92.2%～110.2%，相對標準偏差不大于8.7%。

電化學免疫傳感器；AuAg納米材料；金納米/氧化石墨烯復合材料；癌抗原-153

癌抗原-153(CA-153)是臨床檢查乳腺癌最重要的特異性標志物[1-2]。乳腺癌患者初期約有60%的血清CA-153水平明顯升高，而轉移性乳腺癌患者可達80%，CA-153是乳腺癌輔助診斷指標，也是復發和轉移的重要信號，因此對于CA-153的高選擇性和高靈敏性檢測在醫學診斷領域具有重要意義[3-4]。目前對CA-153的檢測多采用辣根過氧化物酶作標記物研制電化學傳感器[5-6]，建立化學發光酶聯免疫傳感器[7-9]、表面等離子體共振生物傳感器[8]等免疫分析方法。電化學免疫傳感器具有選擇性好、靈敏性高、操作簡單、線性范圍較寬[10-11]等特點，但其靈敏度依靠生物分子固定和信號放大來提高[12]，但化學發光酶聯免疫傳感器和表面等離子體共振生物傳感器的制備復雜且成本高，酶易失活，影響傳感器的壽命，在實際應用時測定結果的準確性受到限制[13-14]。

納米材料與辣根過氧化物酶相比具有易制備、成本低、易保存、易修飾和標記[15-16]等優越性。復合納米材料具有不同于單組分納米材料的獨特的光、電和催化等性質，已成為當前納米材料科學研究領域中的前沿和熱點[17-18]。金屬復合納米粒子比單組分粒子的催化性能更優越，采用金屬復合材料[19-20]固定生物分子，可實現高靈敏、快速的電化學檢測。

本文利用金銀立方體納米材料作為標記物構建了電化學免疫傳感器，用于乳腺癌標志物CA-153的高靈敏、快速檢測。將CA-153抗體固定于AuNPs/GO/GCE傳感界面，CA-153 抗原被捕獲，與標記金銀立方體納米材料的CA-153抗體結合，制備夾心型的電化學免疫傳感器。金銀立方體納米材料催化H2O2對電子酶介體硫堇氧化反應，產生電流信號，該電流信號與CA-153濃度的對數成正比，據此實現了CA-153的定量檢測。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

癌抗原153(CA-153)、癌抗原125(CA-125)、癌抗原199(CA-199)、癌胚抗原(CEA)、單克隆抗體CA-153(捕獲抗體Ab1，標記抗體Ab2)、α-甲胎蛋白(AFP)和人絨毛促性腺激素(HCG)均購自上海領潮生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)、聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)、硫堇(TH)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)購自上海國藥集團有限公司；pH 7.0 10 mmol/L磷酸溶液(10 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20和BSA 1%)為孵育及洗滌液；所用試劑均為分析純。

JEM 1400透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；電化學阻抗的測定使用交流電壓5 mV，頻率范圍0.01 Hz～3 MHz，5 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-(含0.1 mol/L KCl)過電化學工作站(德國Zahner公司)進行；電化學測量以玻碳電極(直徑3 mm)為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，Pt電極為輔助電極(對電極)，采用三電極體系通過CHI760D電化學工作站(上海辰化儀器有限公司)進行。

1.2實驗過程

1.2.1AuNPs/GO 納米復合物的制備檸檬酸鈉還原氯金酸制備納米金溶膠(AuNPs)[21]。AuNPs/GO納米復合物的制備參照文獻[22-23]，取2.0 mL GO(0.5 mg/mL)分散液與4 mL PDDA(質量分數1%)溶液混合，超聲30 min混勻。以5 000 r/min離心后用蒸餾水洗滌分散至2.0 mL水中，獲得PDDA-GO溶液。在該溶液中緩慢滴加5.0 mL AuNPs 溶液，超聲30 min后離心洗滌3次，分散至2.0 mL水中，得AuNPs /GO溶液。

1.2.2金銀立方體納米粒子(AuAg CNPs)的制備[24]將50 μL 2.0 mmol/L HAuCl4·4H2O溶液和50 μL 2.0 mmol/L AgNO3溶液快速混合加入2.0 mL水中，隨后立即加入10 μL 0.1 mmol/L抗壞血酸，劇烈攪拌，30 s內溶液顏色變藍，表明AuAg NPs形成。隨后加入1 mL 0.1 mmol/L的CTAB用于穩定納米粒子及保持其分散性，將上述溶液離心(8 000 r/min，5 min)，用水洗滌3次。

Ab2/AuAg NPs制備:將20 mg AuAg NPs超聲分散至2 mL磷酸緩沖液(PBS，50 mmol/L，pH 6.8)中，再加入500 μL Ab2(0.2 mg/mL)，在4 ℃下輕輕攪拌，孵化12 h，6 000 r/min離心5 min后用PBS洗滌，離心后洗滌，重復操作3次，加入 1.0%BSA溶液封閉剩余活性位點。制得的Ab2/AuAg NPs復合物于4 ℃下儲存。

1.3電化學免疫傳感器的制備

將玻碳電極(Φ=3 mm)分別在粒徑為 1.0，0.3，0.05 μm 的Al2O3糊中拋光打磨，用二次水和乙醇分別超聲清洗，吹干備用。將10 μL Au NPs/GO溶液滴涂到電極上，室溫下晾干。將10 μL Ab1滴至AuNPs/GO/GCE上孵育2 h，抗體與Au NPs相連接，用1.0% BSA封閉活性位點，30 min后用 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)清洗，除去非特異性吸附抗體。將5 μL不同濃度的CA-153滴涂到電極表面，孵育40 min，制得CA-153/Ab1/AuNPs/GO/GCE電極(見圖1)，然后將5 μL Ab2/AuAg NPs滴至電極表面，孵育40 min，二次水洗滌3次，置于pH 7.0 PBS溶液中，在H2O2濃度為2.0 mmol/L，硫堇濃度為1.0 mmol/L條件下，采用差分脈沖法對CA-153進行檢測。

2　結果與討論

2.1納米材料的表征

圖2A為石墨烯的透射電子顯微鏡圖(TEM)，可以看出石墨烯絲綢狀褶皺的表面特征及不規則、大小不同的碎片；圖2B為AuNPs的TEM 照片，可觀察到粒徑在10～20 nm左右，大小均一，分散較好；圖2C為Au NPs與GO復合物的TEM照片，由圖可見GO上分布有很多Au NPs，說明Au NPs 已組裝到GO上，此結果表明采用該方法可有效地固載大量Au NPs。AuAg納米材料的掃描電鏡(SEM)圖則表明AuAg納米材料具有立方結構，邊長約為50 nm，分散均勻，尺寸均一(圖2D)。

采用ζ-電位對材料的組裝方式進行表征，結果顯示，GO帶負電，這主要由于GO表面帶有羧基、羥基等基團；帶正電荷的PDDA被吸附于GO表面，使得GO-PDDA帶有正電荷；而帶負電的Au NPs與帶正電的PDDA相互吸附后，形成了Au NPs/GO復合物，Au NPs/GO整體呈負電。

2.2免疫傳感器修飾過程的電化學表征

在電極修飾過程中，可采用電化學方法表征電極電流的變化。圖3A顯示了不同修飾電極于修飾過程中的電流變化曲線。結果顯示，Ab1/Au/GO/GCE在pH 7.0 PBS中無明顯的氧化還原峰(曲線a)。當Ab1/Au/GO/GCE在CA-153樣品溶液中孵育一段時間后，有低電流出現(曲線b)，表明形成的抗原抗體復合物阻礙了電子傳遞。當Ab2/AuAg NPs發生免疫反應后，在-0.19 V和-0.25 V處出現1對明顯的氧化還原峰(曲線c)，這是Ab2/AuAg NPs催化硫堇的氧化還原信號，當反應條件在pH 7.0 PBS(含2.0 mmol/L H2O2)時，免疫傳感器發生催化現象，陰極峰升高，陽極峰降低(曲線d)，說明在電子媒介體TH的作用下，由Ab2/AuAg NPs復合材料中的類辣根過氧化物酶催化H2O2還原反應產生了催化電流。曲線e和f顯示，Ab2/Ag NPs和Ab2/Au NPs在體系中對氧化還原峰略有增強作用，但氧化還原峰電位未發生變化，說明Ag和Au納米材料僅起到信號增強作用，并無AuAg納米粒子類酶催化特性。

在電極的修飾過程中,EIS 能給出電極表面阻抗的變化情況。圖3B是不同修飾電極于 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3--0.10 mol/L KCl(pH 7.0) PBS溶液中的交流阻抗譜，曲線a為裸電極的阻抗曲線，曲線b為修飾Au NPs/GO后的阻抗曲線。修飾后電極的阻抗值變大，原因在于Au NPs/GO略微降低了電子的傳輸。抗體Ab1修飾Au/GO/GCE后，阻抗值進一步增大(曲線c)；采用BSA封閉活性位點后，減少了對抗原的非特異性吸附，由于BSA的導電性差，阻抗值繼續增大(曲線d)。加入抗原CA-153發生免疫反應后，阻抗值增大(曲線e)，表明電子的傳遞受到抗體和抗原的阻礙作用；修飾Ab2/AuAg NPs后，阻抗值進一步增大(曲線f)，表明電子的傳遞受到了非導電性物質抗體的阻礙作用。

2.3實驗條件的優化

由于酸度對免疫傳感器有較大影響，因此檢測了免疫傳感器在pH 5.0～9.0 PBS溶液中的電化學信號。結果顯示，當pH值由5.0增至6.8時，電流強度隨之增大；在pH 7.0左右，電流強度最大且穩定；pH值高于7.6后電流強度逐漸減小。因此，實驗選擇pH 7.0作為最佳pH值。孵育時間也是影響免疫反應的重要因素，實驗結果顯示，響應電流隨反應時間的增加而增強，在40 min 時，響應電流基本平穩，因此選擇最佳免疫反應時間為40 min。同樣考察了溫度對免疫反應的影響，實驗結果表明，隨著孵育溫度的提高，電流響應增大，當達到35 ℃時，電流出現最大值，隨后開始降低，因此實驗選擇在35 ℃下進行。

2.4試劑濃度的選擇

H2O2和硫堇濃度對傳感器性能有著非常大的影響。在pH 7.0 PBS緩沖溶液中，考察了H2O2和硫堇濃度對10 U/mL CA-153電流信號的影響。結果顯示，峰電流均隨著H2O2和硫堇濃度的增加而增大，電流信號分別在H2O2濃度為2.0 mmol/L、硫堇濃度為1.0 mmol/L時達到最大并趨于穩定，因此實驗選擇H2O2和硫堇的最佳濃度分別為2.0 mmol/L和1.0 mmol/L。

2.5免疫傳感器的重現性、穩定性及選擇性

采用電化學免疫傳感器對4種不同濃度(0.5，5，20，100 U/mL)的CA-153樣品進行5次測量，得到相對標準偏差(RSD)分別為3.7%，2.5%，4.1%，3.9 %。表明構建的傳感器具有很好的重現性。

將免疫電極置于0.1 mol/L pH 7.0 PBS(含2 mmol/L H2O2)中，工作100個循環后，峰電流只降低了3.2%。干燥處理后于4 ℃保存30 d，測得信號為原信號的91.4%。推測因為復合物上固定的抗體逐漸失活而導致電流緩慢降低。

為驗證免疫傳感器的抗干擾能力，將20 U/mL的CA-153分別與相同量的CA-125,CA-199和20 ng/mL的HCG，PSA，CEA，AFP共存，其電流響應與單獨測定CA-153時相差不大，說明共存腫瘤標記物引起的干擾可以忽略不計，表明此傳感器具有良好的選擇性。

2.6分析性能

在最佳條件下，免疫傳感器的差分脈沖伏安峰電流值與CA-153濃度的對數值在2.0×10-5～100 U/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為I=59.22+9.02lgc(U/mL)，相關系數為0.998 1，檢出限(信噪比的3倍標準偏差)為7.0×10-6U/mL。正常人CA-153值為0～25 U/mL，結果表明，該方法檢出限完全滿足檢測要求。

表1　實際樣品的測定

*n=5

2.7實際樣品的測定

用電化學免疫傳感器對癌癥患者血清樣品進行檢測，若含量超過檢測上限，采用PBS溶液進行稀釋。采用標準加入法進行回收實驗，對4個血液樣品平行測定5次，結果如表1所示。測定結果RSD不大于8.7%，回收率為92.2%～110.2%，該方法具有較好的精密度。

3　結　論

基于Au NPs/GO復合材料構建了一種用于腫瘤標志物CA-153檢測的電化學免疫傳感器傳感界面，Au NPs/GO復合材料具有良好的生物相容性，可增加抗體在電極表面的固載量并保持其良好的生物活性。AuAg納米立方體還具有類辣根過氧化物酶特性，用于抗體標記，可提高電極的穩定性，且利于免疫傳感器信號放大和靈敏度提高。該電化學免疫傳感器制備簡單，測定結果準確可靠，對CA-153的檢測具有線性范圍寬、檢出限低等優點，有望用于實際樣品的測定。

[1]Ge S G,Sun M W,Liu W Y,Li S,Wang X,Chu C C,Yan M,Yu J H.Sens.ActuatorB,2014,192:317-326.[2]Wu J,Yan Y T,Yan F,Ju H X.Anal.Chem.,2008,80(15):6072-6077.

[3]Tang J,Tang D P,Niessner R,Chen G N,Knopp D.Anal.Chem.,2011,83(13):5407-5414.

[4]Kudryavtsev A N,Krasitskaya V V,Petunin A I,Burakov A Y,Frank L A.Anal.Chem.,2012,84(7):3119-3124.[5]Tang D P,Su B L,Tang J,Ren J J,Chen G N.Anal.Chem.,2010,82(4):1527-1534.

[6]Liu R,Liu X,Tang Y R ,Wu L,Hou X D,Lv Y.Anal.Chem.,2011,83(6):2330-2336.

[7]Fang S,Zhang B,Ren K W,Cao M M,Shi H Y,Wang M H.J.Agric.FoodChem.,2011,59(5):1594-1597.

[9]Xu S J,Liu Y,Wang T H,Li J H.Anal.Chem.,2011,83(10):3817-3823.

[10]Lu D L,Wang J,Wang L M,Du D,Timchalk C,Barry R,Lin Y H.Adv.Funct.Mater.,2011,21(22):4371-4378.[11]Xu Q N,Yan F,Lei J P,Leng C,Ju H X.Chem.Eur.J.,2012,18(16):4994-4998.

[12]Wang G F,Huang H,Zhang G,Zhang X J,Fang B,Wang L.Langmuir,2011,27(3):1224-1231.

[13]Adriano A,Federico A,Arben M.Anal.Chem.,2010,82(3):1151-1156.

[14]Zhu C Z,Yang G H,Li H,Du D,Lin Y H.Anal.Chem.,2015,87(1):230-249.

[15]Zheng T T,Zhang Q F,Feng S,Zhu J J,Wang Q,Wang H.J.Am.Chem.Soc.,2014,136(6):2288-2291.

[16]Ling P H,Lei J P,Zhang L,Ju H X.Anal.Chem.,2015,87:3957-3963.

[17]Xu C X,Hao Q,Duan H M.J.Mater.Chem.A,2014,2:8875-8880.

[18]Li Y Y,Xu C X,Li H,Wang H,Wu D,Ma H M,Cai Y Y,Du B,Wei Q.Biosens.Bioelectron.,2014,56:295-299.[19]Lai G S,Wu J,Ju H X,Yan F.Adv.Funct.Mater.,2011,21:2938-2943.

[20]Yang W R,Ratinac K R,Ringer S P,Thordarson P,Gooding J J,Braet F.Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49:2114-2138.

[21]Zhang C,Zhang Z Y,Yu B B,Shi J J,Zhang X R.Anal.Chem.,2002,74(1):96-99.

[22]Enustun B V,John T.J.Am.Chem.Soc.,1963,85(21):3317-3328.

[23]Liu K P,Zhang J J,Wang C M,Zhu J J.Biosens.Bioelectron.,2011,26:3627-3632.

[24]Wang D S,Li Y D.Adv.Mater.,2011,23(9):1044-1060.

A Highly Sensitive CA-153 Sensor Based on AuAg Cube Nanomaterial

JIA Cui-juan1*,ZHANG Si-bao2,DU Zhang-zhang1

(1.Department of Biology and Chemical Engineering,Jining Vocational Technology College,Jining272037,China；2.Chemical Technology Academy of Shandong,Jinan250014,China)

Cancer antigen-153(CA-153) was very significant specific tumor marker.An Au nanoparticles/graphene oxide(Au NPs/GO)-based electrochemical immunosensing platform was fabricated for the sensitive detection of CA-153 by the sandwich immunoassay protocol.Au NPs/GO composite material was used to modify the glassy carbon electrode.CA-153 antibody was anchored on the surface of Au NPs by the absorbtion of Au NPs and CA-153 antibody.Bovine Serum Albumin(BSA) was used to block possible remaining active sites of nanomaterials and avoid the nonspecific adsorption.AuAg cube nanomaterial available to catalyze the reduction of hydrogen peroxide was used to lable antibody(Ab2).The electrochemical signals derived from the carried AuAg cube toward the reduction of H2O2using the thionine as electron mediator,and were measured by differential pulse voltammetry.Under the optimized experimental conditions,the linear range and the detection limit(S/N=3) of CA-153 immunosensor were 2.0×10-5-100 U/mL and 7.0×10-6U/mL,respectively.The proposed method was applied in the detection of CA-153 in spiked human serum samples with recoveries of 92.2%-110.2% and RSD not more than 8.7%.

electrochemical immunosensor；AuAg nanoparticles；Au nanoparticle/graphene oxide composites;cancer antigen-153

2015-07-27；

2015-12-17

賈翠娟，碩士，講師，研究方向:生物分析化學，Tel:0537-2232873，E-mail:2293622049@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.013

O657.1；S852.43

A

1004-4957(2016)06-0709-05