pH區(qū)帶逆流色譜分離制備金果欖中的巴馬汀及藥根堿

劉　倩，孫常磊，宮成玉，楊　鵬,李大鵬，王　曉*

(1.山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東　濟(jì)南　250014；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)　食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東　泰安　271018；3.煙臺出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東　煙臺　264000；4.濟(jì)南康森三峰生物工程有限責(zé)任公司，山東　濟(jì)南　250014)

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pH區(qū)帶逆流色譜分離制備金果欖中的巴馬汀及藥根堿

劉倩1,2，孫常磊1，宮成玉3，楊鵬4,李大鵬2，王曉1*

(1.山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；3.煙臺出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺264000；4.濟(jì)南康森三峰生物工程有限責(zé)任公司，山東濟(jì)南250014)

采用一種高效的pH區(qū)帶逆流色譜方法分離制備金果欖中的巴馬汀和藥根堿，以氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)為溶劑系統(tǒng)，在上相中加入20 mmol/L的HCl作為固定相，在下相中加入10 mmol/L三乙胺作為流動(dòng)相，流速為2.0 mL/min，儀器轉(zhuǎn)速為850 r/min。經(jīng)一次pH區(qū)帶逆流色譜分離，從2 g粗提物中得到512 mg巴馬汀和421 mg藥根堿。經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，其純度均大于95%，采用MS，1H NMR和13C NMR對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定。該方法具有簡便、快捷、重現(xiàn)性好、上樣量大等特點(diǎn)，可快速高效地分離制備金果欖中的巴馬汀和藥根堿。

pH區(qū)帶逆流色譜；高效液相色譜(HPLC)；巴馬汀；藥根堿；金果欖

金果欖為防己科植物青牛膽Tinosporasagittata(Oliv.) Gagnep.或金果欖TinosporacapillipesGagnep.的干燥塊莖，具有清熱解毒、利咽止痛等功效[1]。內(nèi)服用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎、急性胃腸炎、菌痢、癰腫疔癤等多種炎癥；外用浸膏、磨汁涂搽或研末調(diào)搽用以治療靜脈炎、毒蛇咬傷等癥[2]，主要活性成分為生物堿類化合物巴馬汀和藥根堿[3]。由于二者是結(jié)構(gòu)和極性極其相似的季銨類生物堿，用傳統(tǒng)的柱色譜方法分離，存在耗時(shí)長、樣品不可逆吸附及回收率低等缺點(diǎn)，為了建立金果欖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)一步研究其藥理活性，研究一種快速高效地從金果欖中分離制備高純度生物堿的方法具有重要意義。

pH區(qū)帶逆流色譜(PZRCCC)是在高速逆流色譜(HSCCC)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種特殊的分離制備技術(shù)，依據(jù)化合物的解離常數(shù)(KD) 和疏水性的不同實(shí)現(xiàn)分離，適于可解離化合物(如有機(jī)酸和生物堿)的制備性分離，具有制備條件易優(yōu)化、制備量大、分離餾分高度濃縮以及可通過pH值檢測無紫外吸收的化合物等特點(diǎn)[4-6]。本研究采用pH區(qū)帶逆流色譜法，通過優(yōu)化兩相溶劑系統(tǒng)，對金果欖總生物堿進(jìn)行了分離純化，得到2個(gè)高純度的生物堿單體巴馬汀和藥根堿(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

TBE-300型高速逆流色譜儀購于上海同田生化技術(shù)有限公司(包括S-1007單缸柱塞泵和8823B紫外檢測器，聚四氟乙烯管，管內(nèi)徑1.6 mm，螺旋管總體積300 mL，轉(zhuǎn)速0～1 000 r/min)；Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)，配有光電二極管陣列檢測器(PDA)，購于美國Waters公司；Varian INOVA-400核磁共振波譜儀(美國Varian公司)；Agilent 1100 series 6320 ion-trap 質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)。

金果欖總生物堿的制備以及pH區(qū)帶逆流色譜所用甲醇、氯仿、石油醚和乙酸乙酯均為分析純(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；HPLC用甲醇、乙腈為色譜純(美國天地公司)，HPLC實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；其他實(shí)驗(yàn)用水為過濾蒸餾水。

金果欖藥材購自山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為防己科植物金果欖TinosporacapillipesGagnep.的干燥塊莖。

1.2金果欖總生物堿的制備

取金果欖藥材2 kg，粉碎過40目篩；用10 L乙醇(90%)回流提取3次，每次2 h，過濾，合并提取液；減壓回收乙醇，得濃縮液2 L；用HCl調(diào)至pH 2.0，用等體積石油醚萃取濃縮液后，再用氨水調(diào)至pH 10.0，最后用等體積的氯仿連續(xù)萃取3次，合并萃取液，減壓回收氯仿，得金果欖總生物堿15 g，置于冰箱內(nèi)備用。

1.3兩相溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備

pH區(qū)帶逆流色譜溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)，總體積為1.8 L，按比例將上述溶劑置于分液漏斗中混合，振蕩后充分靜置使其分層。使用前分取上下相，在上相中加入20 mmol/L HCl作為固定相，下相中加入10 mmol/L三乙胺作為流動(dòng)相，超聲除去氣泡，備用。

稱取2 g金果欖總生物堿置于試管中，加入10 mL已添加鹽酸的上相和10 mL未加三乙胺的下相，超聲振蕩使樣品溶解，制備成樣品溶液。

1.4pH區(qū)帶逆流色譜分離過程

溶劑系統(tǒng)中的上相(固定相)以20 mL/min流速注滿高速逆流色譜儀的螺旋管，待出口流出一定量的液體(約50 mL)，調(diào)整分離柱轉(zhuǎn)速為850 r/min，將上述溶解好的樣品溶液20 mL用注射器注入進(jìn)樣圈，同時(shí)下相(流動(dòng)相)以2.0 mL/min流速泵入。開啟檢測器和記錄儀，檢測器的檢測波長為254 nm，記錄儀靈敏范圍1 A，量程100 mV，記錄紙速度6 cm/h，根據(jù)記錄的色譜圖收集色譜平臺組分。待分離結(jié)束，用壓縮空氣吹出螺旋管中的液體，計(jì)算固定相的保留率。

1.5HPLC分析及結(jié)構(gòu)鑒定

金果欖總生物堿和pH區(qū)帶逆流色譜分離得到的各組分均采用HPLC進(jìn)行分析。HPLC條件：色譜柱為Waters C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；檢測波長為254 nm；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液(30∶70)，等度洗脫，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式檢測，樣品通過流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，流速為0.2 mL/min，干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流量為9.0 L/min，霧化氣壓力為2.38 MPa，毛細(xì)管電壓為4 kV，質(zhì)量掃描范圍為m/z50～1 200，實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)經(jīng)過校正。

2　結(jié)果與討論

2.1HPLC條件的優(yōu)化

根據(jù)溶質(zhì)電離理論，當(dāng)流動(dòng)相的pHpKb時(shí)，生物堿溶質(zhì)以中性狀態(tài)為主，在C18上的保留增強(qiáng)。因此，當(dāng)流動(dòng)相的pH≈pKb時(shí)，保留時(shí)間則隨著pH值的微小變化而靈敏變化，使色譜分離的重復(fù)性較差；當(dāng)pH≥pKb±2時(shí)，保留時(shí)間穩(wěn)定，即色譜分離有較好的重復(fù)性[7-9]。巴馬汀的pKb為4.3，故溶劑系統(tǒng)的pH值一般不宜選在4.3附近[10]。本研究分別考察了乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(pH 4.6)、乙腈-0.4 mol/L氯化銨(pH 5.3)和乙腈-0.2%磷酸(pH 2.1)作為HPLC流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果表明，用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀和乙腈-0.4 mol/L氯化銨流動(dòng)相時(shí)的峰形拖尾，拖尾因子超過1.05；當(dāng)采用乙腈-0.2% 磷酸作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫(30∶70)，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min時(shí)，保留時(shí)間適宜，峰形較好，無拖尾，各成分可以實(shí)現(xiàn)基線分離，分離效果如圖2A所示。

2.2pH區(qū)帶逆流色譜分離條件的優(yōu)化

在pH區(qū)帶逆流色譜分離制備中藥活性成分的過程中，最關(guān)鍵是選擇合適的兩相溶劑系統(tǒng)。合適的兩相溶劑系統(tǒng)不僅能提供理想的分配系數(shù)KD，即滿足Kacid?1和Kbase?1，而且滿足樣品在溶劑系統(tǒng)中有良好的溶解度[11-13]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以及本實(shí)驗(yàn)室在高速逆流色譜分離制備化合物方面的經(jīng)驗(yàn)，首先選擇極性范圍較廣的四元溶劑系統(tǒng)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水。另外，考慮到所分離的化合物為生物堿，選用三乙胺作為保留劑，鹽酸作為洗脫劑進(jìn)行分離。在溶劑系統(tǒng)方面，考察了石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶5∶5)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶3∶7)的分離效果，4種溶劑系統(tǒng)中均在上相加10 mmol/L三乙胺，下相加10 mmol/L鹽酸。結(jié)果顯示，前3個(gè)溶劑系統(tǒng)的KD不滿足Kacid?1和Kbase?1的要求，溶劑系統(tǒng)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶3∶7)雖然能夠提供較為合適的KD值，但金果欖總生物堿在該溶劑系統(tǒng)中溶解度太小，不能進(jìn)行制備級分離。

考慮到季銨型生物堿的理化性質(zhì)，以及該類化合物在氯仿中的溶解度，且氯仿常用于生物堿的萃取純化，因此將溶劑系統(tǒng)選定為氯仿-甲醇-水，并在上相加20 mmol/L鹽酸作為保留劑，下相加10 mmol/L三乙胺作為洗脫劑，對不同的溶劑比例(2∶1∶1,4∶3∶3,4∶3∶2)進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯仿-甲醇-水(4∶3∶3)和(4∶3∶2)不僅能夠提供合適的分配系數(shù)，而且溶解度得到大幅提高[14-15]。進(jìn)一步測試發(fā)現(xiàn)，溶劑系統(tǒng)氯仿-甲醇-水(4∶3∶3)雖有一定的分離趨勢，但未能形成明顯的pH區(qū)帶，分離結(jié)果如圖3A所示。而溶劑系統(tǒng)氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)能夠在4 h內(nèi)形成兩個(gè)不規(guī)則的矩形峰，且雜質(zhì)成分被富集在兩個(gè)矩形峰之間，實(shí)現(xiàn)了化合物的成功分離，分離效果如圖3B所示。因此，最終選定氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)作為溶劑系統(tǒng)，并在上相固定相中加入20 mmol/L鹽酸作為保留劑，下相流動(dòng)相中加入10 mmol/L三乙胺作為洗脫劑，對金果欖中的生物堿成分進(jìn)行分離。經(jīng)一次pH區(qū)帶逆流色譜分離，從2 g金果欖總生物堿中分離得到巴馬汀(512 mg)和藥根堿(421 mg)，經(jīng)HPLC分析，純度分別為95.1%和95.3%，分析結(jié)果如圖2B～C所示。

2.3pH區(qū)帶逆流色譜分離組分的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物a：ESI-MSm/z:353[M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):9.86(1H,s,H-8),9.04(1H,s,H-13),8.17(1H,d,J=9.2 Hz,H-11),8.02(1H,d,J=9.2 Hz,H-12),7.69(1H,s,H-4),7.07(1H,s,H-1),4.93(2H,t,J=6.4 Hz,H-6),4.08(3H,s,9-OCH3),4.05(3H,s,10-OCH3),3.92(3H,s,2-OCH3),3.85(3H,s,3-OCH3),3.21(2H,t,J=6.4 Hz,H-5);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):152.4(C-9),150.1(C-3),149.8(C-2),145.8(C-8),143.8(C-10),138.4(C-13a),134.5(C-4a),129.1(C-13b),127.3(C-13),123.9(C-12),122.0(C-12a),120.8(C-8a),112.4(C-4),112.0(C-11),108.9(C-1),62.1(C-9a),57.6(C-3a),56.8(C-2a),56.3(C-10a),56.1(C-6),27.0(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的基本一致，由此確定化合物a為巴馬汀。

化合物b：ESI-MS,m/z:338[M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):9.71(1H,s,H-8),8.74(1H,s,H-13),8.08(1H,d,J=8.0 Hz,H-11),7.97(1H,d,J=8.0 Hz,H-12),7.63(1H,s,H-1),6.84(1H,s,H-4),4.48(2H,m,H-6),4.18(3H,s,9-OCH3),4.09(3H,s,10-OCH3),4.00(3H,s,2-OCH3),3.18(2H,m,H-5);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):150.6(C-9),150.5(C-2),148.4(C-3),145.0(C-8),144.5(C-10),139.1(C-13a),134.2(C-12a),129.1(C-4a),126.8(C-12),123.1(C-11),122.0(C-13b),119.7(C-13),118.2(C-8a),114.7(C-4),108.8(C-1),61.3(9-OCH3),56.4(2-OCH3),56.2(C-6),55.7(10-OCH3),26.4(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的基本一致，由此確定化合物b為藥根堿。

3　結(jié)　論

本研究運(yùn)用pH區(qū)帶逆流色譜技術(shù)成功分離了金果欖中的季銨型生物堿類化合物，通過優(yōu)化，最終選用氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)作為溶劑系統(tǒng)，并在上相中加入20 mmol/L鹽酸作為保留劑，下相中加入10 mmol/L三乙胺作為洗脫劑，經(jīng)一次pH區(qū)帶逆流色譜分離，在4 h內(nèi)從2 g金果欖總生物堿中分離得到巴馬汀(512 mg)和藥根堿(421 mg)，經(jīng)HPLC分析，純度均在95%以上。研究結(jié)果表明pH區(qū)帶逆流色譜技術(shù)在分離制備中藥中生物堿類化合物時(shí)，具有操作簡單、快速高效、制備量大等特點(diǎn)，可作為中藥活性成分(生物堿和有機(jī)酸)研究的有效方法進(jìn)行推廣。

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Preparative Separation of Palmatine and Jatrorrhizine from Tinospora Capillipes Gagnep.by pH-Zone-refined Counter-current Chromatography

LIU Qian1,2,SUN Chang-lei1,GONG Cheng-yu3,YANG Peng4,LI Da-peng2,WANG Xiao1*

(1.Key Laboratory of TCM Quality Control Technology,Shandong Analysis and Test Center,Shandong Academy of Sciences,Jinan250014,China;2.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian271018,China;3.Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yantai264000,China;4.Kangsen Sanfeng Biological Engineering Technology Co.,Jinan250014,China)

An efficient method was developed for the preparative separation of palmatine and jatrorrhizine fromTinosporacapillipesGagnep.by pH-zone-refined counter-current chromatography(CCC). The two-phase solvent system of chloroform-methanol-water(4∶3∶2) was selected,in which hydrochloric acid(20 mmol/L) was added into the upper aqueous phase as the stationary phase,and triethylamine(10 mmol/L) was added to the lower orgnic phase as the mobile phase.The apparatus was rotated at a speed of 850 r/min,while the mobile phase was pumped into the column at 2.0 mL/min.From 2 g of crude extract,512 mg palmatine and 421 mg jatrorrhizine with purities of 95.1% and 95.3% were obtained.The chemical identification of the isolated compounds was carried out by electrospray ionization-mass spectrometry(ESI-MS),1H NMR and13C NMR.The introduced method is a rapid and efficient approach for the preparative separation of palmatine and jatrorrhizine intinosporacapillipesgagnep.

pH-zone-refined counter-current chromatography;high performance liquid chromatogranphy(HPLC);palmatine;jatrorrhizine;TinosporaCapillipesGagnep.

2015-12-23；

2016-01-28

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GZX219003)

王曉，博士，研究員，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，Tel:0531-82605304，E-mail:wangx@sdas.org

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.021

O657.7;TQ460.72

A

1004-4957(2016)06-0748-05