化療后肝癌侵襲轉移潛能的變化及其機理的實驗研究

劉　俊　孫秋實

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化療后肝癌侵襲轉移潛能的變化及其機理的實驗研究

劉俊孫秋實

目的探討化療后肝癌侵襲轉移潛能的變化及其機理。方法運用基因芯片的方法篩查出人肝癌的相關因子，在篩查出的因子中進一步用免疫組化進行驗證，化療前和化療后進行比較。由于化療后腫瘤侵襲轉移能力減弱，所以進一步檢測其侵襲轉移變化，通過免疫熒光檢測進行確認。染色指標為LYVE-1(標記微淋巴管)和VEGF，檢測樣本化療后組織，化療前組織。結果檢測臨床樣本中相關因子的表達，在檢測結果中發現在化療后VEGF低表達，為了確定這一結果，采用免疫組化進一步確定了這一結果，發現化療前高表達VEGF，P<0.05。免疫熒光結果顯示在低表達VEGF時的癌組織中淋巴管的表達也降低(相比于癌旁組織和正常組織)。結論化療后VEGF可以通過調節淋巴內皮細胞進行抑制肝癌細胞的侵襲轉移。

血管表皮生長因子；肝癌；淋巴管；化療

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.002

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1050～1052)

在西方國家中，肝癌在腫瘤疾病中處于第二難治愈腫瘤。肝癌的發病率和死亡率在惡性腫瘤中上升至第三位，我國和全世界范圍的發病率和死亡率仍處于上升趨勢[1-2]。盡管預防措施和治療手段不斷改進，但肝癌轉移患者5年的生存率仍低于10%[3-4]，及時控制腫瘤的發生發展和抑制轉移是提高生存率的有效手段。肝癌的擴散有很多方式，淋巴管的浸潤和轉移是其最為常見的方式[5-6]。

表皮生長因子刺激增殖，促進淋巴管的生成和血管新生。據研究表明，VEGF在腫瘤組織中的表達和淋巴結的轉移呈正相關。早期的研究表明VEGF家族和其受體在肝癌中會引起肝癌細胞的浸潤，而且有學者證實VEGF的高表達是促進了其腫瘤相關的淋巴管擴張，因此在肝癌轉移中抑制淋巴管的生成成為一個很有效的方式[7]。所以我們需要證實在化療后肝癌中VEGF是否會引起淋巴管和血管的變化，進而引起化療后肝腫瘤的變化。

1　材料與方法

1.1模型構造

收集我院腫瘤科化療后肝癌患者樣本22例和化療前肝癌組織的樣本22例進行對照，患者各類臨床資料均良好保存。

1.2方法

1.2.1RT-PCR試劑及方法逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，稱取等量組織或血清，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min，離完后分為3層，取最上層(中間一層為蛋白)至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數次，室溫沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，顛倒數次混勻；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，棄上清液，小心吸盡液體(此時可以看到白色沉淀即為RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。采用(Ambion公司)小分子分離試劑盒分理處小分子RNA，基因芯片購自于Affymetrix Human Geome公司。

1.2.2免疫組化①脫蠟：按照常規脫蠟方法，在二甲苯，無水乙醇，95%乙醇，90%乙醇，85%乙醇，80%乙醇脫蠟，大約每次時間為10 min。②抗原修復：PBS洗后，加入3%H2O2，37 ℃浸泡10 min，從而除去內源性的過氧化氫酶，PBS洗，再加入檸檬酸緩沖液，高溫高壓修復5 min，冷卻至室溫。③血清封閉： PBS洗，5 min，洗3次，擦干組織周圍的PBS液，然后10%BSA封閉，放入37 ℃溫箱中1 h。④加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，加完一抗(VEGF，購自于santa)后于4 ℃冰箱中保存過夜。⑤加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37 ℃溫箱中1 h。⑥加顯色劑：將片子從溫箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后加上DAB顯色劑。

1.2.3免疫熒光染色組織經過固定后，蔗糖梯度脫水，冰凍切片，切片厚度為6 μm，高溫修復5 min，待其冷卻后，PBS洗滌(3次，每次5 min)，10%BSA封閉50 min，然后進行一抗染色，過夜，第2天復溫40 min，PBS洗滌(3次，每次5 min)，然后進行熒光二抗染色，一抗為VEGF(抗兔)，購自于santa，1∶100，標記血管內皮細胞，LYVE-1(抗羊)，購自于santa，1∶100，二抗分別選用，抗兔(595 nm)，抗山羊(488 nm)。

1.3統計學處理

用SPSS 11.0統計軟件包處理，統計學方法采用t檢驗，Pearson相關分析，χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1血管表皮生長因子在化療后肝癌中低表達

在我們的研究中發現我們所提取的RNA純度較高，且未出現降解等情況。采取28 s和18 s的比例，28 s和18 s是真核生物rRNA(核糖體RNA)的2個主要亞基，在體內含量較多。28 s/18 s即為衡量提取的RNA完整性的指標，如果28 s/18 s為1.8～2.0表明所提取RNA完整性較好，基本無降解發生。電泳條帶上應是28 s在上，18 s在下，且亮度為28 s是18 s的2倍[8]。詳細結果見圖1。將化療前肝癌組織和化療后肝癌組織進行基因芯片的篩選，在篩選中我們發現VEGF在化療后肝癌中低表達。如圖2所示。

圖1　提取RNA中18 s與28 s的含量

圖2　基因芯片篩選出VEGF在化療的肝癌組織中低表達

2.2化療前后癌組織中VEGF的表達

為了進一步驗證VEGF在化療前后肝癌組織中的表達情況，我們進一步進行了驗證，在化療前后肝癌組織中我們檢測VEGF的表達，在檢測中我們發現22例化療后VEGF低表達，與化療前比較，差異具有統計學意義，P<0.05。見圖3。

圖3　VEGF在化療前后肝癌中的表達情況

2.3組織中LYVE-1和VEGF的檢測

在檢測出VEGF在化療后肝癌組織中低表達后，我們進一步探討VEGF對化療后肝癌細胞侵襲轉移的機制。在前人報道中我們知道淋巴管的生長與侵襲轉移有著密切的關系，因此我們選取化療后肝癌組織和未化療的肝癌組織進行研究(此兩種細胞中癌細胞的數量逐漸增加)，根據前人的研究，我們猜測VEGF影響淋巴管的生成進而影響腫瘤細胞的生長。為了驗證猜測結果我們對2種組織進行免疫熒光標記，發現在未化療肝癌組織中高表達VEGF時其淋巴管和血管內均增高(相比于化療組)，為了證實這種結果是VEGF造成的，我們看到在化療后肝癌組織中VEGF低表達(相比于未化療組)，果然在低表達VEGF時其相對未化療癌組織，淋巴管和血管內均降低。

3　討論

肝癌是人類疾病中惡性程度較高的一類疾病，其主要特點是易發生轉移，特別是淋巴結的轉移。轉移的腫瘤通過血液，淋巴管，進而形成多種其他腫瘤，淋巴管的轉移包括一系列的復雜過程，包括：①原位癌惡性腫瘤細胞擴散至旁邊淋巴管；②腫瘤細胞通過淋巴管轉運至鄰近的淋巴結；③腫瘤細胞在淋巴結中的著落；④轉移性的腫瘤在淋巴結中的擴散[9-10]。

最近的研究多集中在VEGF家族在肝癌中的作用，特別是VEGF-C。VEGF-C是在1996年從人前列腺癌PC-3細胞株中分離出來，其位于染色體4q34，在其編碼外端有7個外顯子，是人類第1個發現的具有促進淋巴管生成的基因[11-12]。VEGF具有誘導淋巴管生成和血管新生的潛能，且能調節生理性的和病理性的血管新生，因此VEGF在腫瘤發生發展和腫瘤侵襲轉移中發揮著重要作用[13]。VEGF主要在血管中表達，它的主要作用就是集中在促進血管新生方面，在腫瘤區域，血管新生是腫瘤發生發展的一個重要原因，所以研究VEGF在化療后肝癌中的研究就顯得尤為重要。

基于本研究展開在化療后進行VEGF的研究，檢測結果發現未化療肝癌組織中高表達VEGF時其淋巴管和血管內均增高(相比于正常組時)，且有統計學差異(分別為P<0.001和P<0.05)，為了證實這種結果是VEGF造成的，我們看到在化療后肝癌旁組織中VEGF低表達(相比于癌組織)，果然在低表達VEGF時其相對癌組織，淋巴管和血管內均降低，所以我們得出結果VEGF可以通過調節淋巴內皮細胞進行減少化療后肝癌的侵襲轉移。通過今后研究愈加深入，VEGF極有可能成為抑制肝癌侵襲轉移的靶向藥物。

[1]Milanizadeh S,Khanyaghma M,Haghighi MM,et al.Molecular analysis of imperativepolymorphisms of MLH1 gene in sporadic colorectal cancer〔J〕.Cancer Biomark,2013,13(6):427-432.

[2]Abdel-Wahab M,El-Ghawalby N,Mostafa M,et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma in lower Egypt,Mansoura Gastroenterology Center〔J〕.Hepatogastroenterology，2007,54(73):157-162.

[3]丁光偉,徐秋霞,楊玉秀,等.肝硬化和肝癌差異基因表達的對比研究〔J〕.胃腸病學和肝病學雜志,2006,15(3)：260-263.

[4]Kojiro M,Kawabata K,Kawano Y,et al.Hepatocellular carcinoma presenting as intrabile duct tumor growth:aclinicopathologic study of 24 cases〔J〕.Cancer,1982,49(10):2144-2147.

[5]Huang J,Deng Q,Wang Q,et al.Exome sequencing ofhepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma〔J〕.Nat Genet,2012,44(10):1117-1121.

[6]黃力文,馬曾辰.原發性肝癌的根治性切除標準〔J〕.中華肝膽外科雜志，2003,9(1)：8-9.

[7]Gargalionis AN,Basdra EK.Insights in microRNAs biology〔J〕.Curr Top Med Chem,2013,13(13):1493-1502.

[8]Ronald JA,Katzenberg R,Nielsen CH,et al.MicroRNA-regulated non-viral vectors with improved tumor specificity in an orthotopic rat model of hepatocellular carcinoma〔J〕.Gene Ther,2013,20(10):1006-1013.

[9]Liu SG,Qin XG,Zhao BS,et al.Differential expression of miRNAs in esophageal cancer tissue〔J〕.Oncol Lett,2013,5(5):1639-1642.

[10]Gui J,Tian Y,Wen X,et al.Serum microRNA characterization identifies miR-885-5p as a potential marker for detecting liver pathologies〔J〕.Clin Sci(Lond),2011,120(5):183-193.

[11]Chen Q,Ge X,Zhang Y,et al.Plasma miR-122 and miR-192 as potential novel biomarkers for the early detection of distant metastasis of gastric cancer〔J〕.Oncol Rep,2014,31(4):1863-1870.

[12]Hansen TB,Jensen TI,Clausen BH,et al.Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges〔J〕.Nature,2013,495(7441):384-388.

[13]Wang L,Yao M,Dong Z,et al.Circulating specific biomarkers in diagnosis of hepatocellular carcinoma and its metastasis monitoring〔J〕.Tumour Biol,2014,35(1):9-20.

(編輯：甘艷)

The Mechanism of Potential Invasion and Metastasis in HCC after Chemotherapy

LIUJun，SUNQiushi.

XiantaoFirstPeople'sHospital,Xiantao,433000

ObjectiveTo study the mechanism of potential invasion and metastasis in HCC after chemotherapy.MethodsRelated gene from HCC tissues were screened by gene array,verificated by IHC,and compared after chemotherapy and before chemotherapy.Because of the decrease of potential invasion and metastasis after chemotherapy,the endothelial lymphatic were detected by IF,LYVE-1,the marker of lymphatic endothelial cell and VEGF was the marker of vascular endothelial cells.Results P<0.05，low expression of VEGF showed low lymph-vessel in cancer tissues.ConclusionVEGF can regulate the endothelial lymphatic to inhibit invasion and metastasis in HCC.

VEGF;HCC;Lymph-vessel;Chemotherapy

433000 湖北省仙桃市第一人民醫院(劉俊)；441021 湖北省襄陽市中心醫院(孫秋實)

孫秋實

R735.7

A

1001-5930(2016)07-1050-03

2015-08-10

2015-12-21)