促性腺激素釋放激素及其受體在人類胚胎著床與早期發(fā)育中的作用

李穎，馮云

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海　200025)

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促性腺激素釋放激素及其受體在人類胚胎著床與早期發(fā)育中的作用

李穎，馮云*

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海200025)

促性腺激素釋放激素(GnRH)與其受體(GnRHR)對人類生殖過程調控具有關鍵作用，在胚胎著床與早期發(fā)育中扮演著重要角色。GnRH不僅通過下丘腦-垂體-性腺軸調控生殖功能與內分泌平衡，還能夠與卵巢、子宮內膜、胎盤、胚胎上的GnRHR結合產生直接作用，實現對胚胎植入與早期發(fā)育過程的全面調控。目前，GnRH激動劑(GnRH-a)也已廣泛應用于控制性促排卵過程，除降調節(jié)作用外，其黃體支持作用亦能有效改善妊娠結局。本文就GnRH/GnRHR在人類胚胎發(fā)育及GnRH-a在助孕治療黃體支持中的應用進行綜述。

促性腺激素釋放激素；促性腺激素釋放激素受體；胚胎著床；早期胚胎發(fā)育；黃體支持

(JReprodMed2016，25(8)：762-766)

促性腺激素釋放激素(GnRH)與其受體(GnRHR)參與人類生殖過程，并起到關鍵性的調控作用，其在胚胎著床與胚胎早期發(fā)育中尤為重要。一方面其通過參與下丘腦-垂體-性腺軸(HPG axis)調控女性生殖功能、維持內分泌的平衡；另一方面，GnRH/GnRHR系統在垂體外廣泛分布于卵巢、子宮內膜、胎盤甚至胚胎表面，通過自分泌/旁分泌的途徑發(fā)揮效應，影響胚胎著床與胚胎早期發(fā)育[1]。目前，輔助生殖技術(ART)已經廣泛應用于臨床，其中GnRH激動劑(GnRH-a)是控制性促排卵過程中較常用到的藥物之一。GnRH-a應用于黃體期降調節(jié)，能有效避免早發(fā)的黃體生成素(LH)峰造成的卵母細胞質量下降和周期取消率高的問題。近年來國內外多項臨床試驗顯示：GnRH-a還可輔助用于體外受精-卵胞漿內單精子注射(IVF/ICSI)周期的黃體支持，能顯著提高種植率、妊娠率及活產率[2-4]。有學者推測GnRH-a可能作用于胚胎、子宮內膜以及卵巢黃體[5-6]，但其主要通過何種途徑發(fā)揮效應，目前仍在探索中。本文就GnRH/GnRHR系統在人類胚胎發(fā)育及GnRH-a在助孕治療黃體支持中的應用進行綜述。

一、GnRH、GnRHR和GnRH-a的類型與結構

1. GnRH：GnRH是下丘腦神經元以脈沖形式合成并分泌入垂體門脈系統的一種十肽激素，最早于1971年由諾貝爾獎得主Andrew V. Schally發(fā)現，隨著研究的深入，其在生殖調控中的重要作用日益明晰。人體中存在GnRH-Ⅰ和GnRH-Ⅱ兩種亞型，分別對應不同的基因片段，但序列結構卻高度保守，具有70%的同源性，二者的區(qū)別僅在于第5/7/8位的3個氨基酸，GnRH-Ⅰ中為酪氨酸/亮氨酸/精氨酸(Tyr/Leu/Arg)，而GnRH-Ⅱ中則為組氨酸/色氨酸/酪氨酸(His/Trp/Tyr)，二者在人體中的分布與作用也有所差異[7]。人腦組織中這兩種類型的GnRH在mRNA與蛋白水平均有表達[8]。GnRH-Ⅰ主要由視前區(qū)和下丘腦基底部的神經元分泌，也可由腦組織其它部位產生，其濃度比GnRH-Ⅱ在腦神經元細胞中高出10～40倍，但其在腦外的濃度并不高；而GnRH-Ⅱ在腦外組織中的濃度遠高于腦內，在女性生殖系統如子宮內膜、卵巢、胎盤等組織中表達豐富[9]。

2. GnRHR：人體中存在與GnRH相對應的兩種受體，即GnRHR-Ⅰ與GnRHR-Ⅱ，二者均屬于G蛋白耦聯受體超家族(GPCRs)，通過磷脂酰肌醇信息系統(磷酸肌醇、Ca2+/鈣調蛋白調節(jié)激酶途徑)發(fā)揮效應。C末端結構域為大多數GPCRs所特有，是與β2抑制蛋白結合并介導受體內吞及脫敏的重要部位。GnRHR-Ⅰ缺乏胞內C末端，故不具備內吞及脫敏功能；GnRHR-Ⅱ具有C末端，可快速內吞及脫敏[10]。分布于中樞與外周組織中的GnRHR的生理特性(對GnRH的親和力、激活或抑制作用等)存在差異，有學者認為是由于受體蛋白在不同組織細胞上的空間結構、細胞內信號轉導通路不同所造成的[11]。

3. GnRH-a：GnRH-a是由天然GnRH置換或去除第6、10位氨基酸后生成，其生物學特性是天然GnRH的50～100倍。GnRH-a通過與GnRHR特異性結合，出現短期的“激發(fā)效應”，使卵泡刺激素(FSH)與黃體生成素(LH)水平短期內升高，長期使用則會出現GnRHR下調，抑制FSH與LH的合成與分泌及卵巢分泌雌、孕激素。目前激動劑藥物的開發(fā)及應用已經比較成熟，根據替換第6、10位氨基酸的不同，GnRH-a種類多樣，包括達必佳(decepeptyl)、達菲林(diphereline)、亮丙瑞林(leuprolide)、諾雷德(goserelin)和布舍瑞林(buserelin)等。

二、GnRH/GnRHR系統及GnRH-a在胚胎著床/早期發(fā)育中的作用

GnRH/GnRHR系統廣泛表達于生殖器官組織如子宮內膜、胎盤、卵巢甚至胚胎，且其在不同部位表現出的生物功能各異，在胚胎著床和早期發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

1. 參與胚胎著床和早期發(fā)育：GnRH/GnRHR系統已被證實存在于著床前的人類胚胎上，且各發(fā)育階段中其表達水平較為穩(wěn)定[12]。Casan等[13]于1999年首次在種植前人類胚胎上檢測到GnRH/GnRHR的表達，并利用RT-PCR技術檢測到不同的胚胎發(fā)育階段(包括8-細胞期、致密化桑椹胚期、擴張囊胚期)均有GnRH/GnRHR mRNA水平的表達；還通過免疫組化的方法對GnRH的蛋白表達進行定位分析，發(fā)現桑椹胚時期卵裂球、囊胚的滋養(yǎng)外胚層/內細胞團上均有強染色。

胚胎的成功著床需要通過“母胎對話”以改善子宮內膜容受性，促進種植窗期內膜與胚胎的同步化。發(fā)育中的人類胚胎可以自身分泌多種生長因子或細胞因子以提高內膜容受性，還可以通過分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)間接作用于卵巢，刺激雌、孕激素分泌并發(fā)揮作用。體外培養(yǎng)實驗表明，移植前的人類胚胎在8-細胞期/囊胚階段可以檢測到轉化生長因子-α(TGF-α)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)等生長因子和白細胞抑制因子(LIF)、抑制素A(inhibin A)、干擾素-β(IFN-β)等細胞因子在mRNA/蛋白水平的表達[14-16]。母體子宮內膜上皮與間質細胞上的GnRH-Ⅰ與GnRH-Ⅱ可以通過旁分泌途徑作用于胚胎滋養(yǎng)層細胞上相應的GnRHR[17]，繼而調控HCG分泌，建立“母胎對話”通路，為胚胎著床創(chuàng)造有利條件[11]。

曹躍齡等[18]在體外培養(yǎng)實驗中研究GnRH-a對人類早期胚胎發(fā)育的影響發(fā)現：培養(yǎng)液中添加GnRH-a組(濃度≥5 μg/ml)的8-細胞期胚胎、桑椹胚/囊胚形成率顯著高于對照組(分別為73.33% vs. 38.46%、53.33% vs. 23.08%，P<0.05)，證明GnRH-a對體外培養(yǎng)的人早期胚胎有促進分裂的作用，且這種作用在8-細胞期就能顯現出來。

2. 調節(jié)子宮內膜及胎盤功能：整個月經周期中，人類子宮內膜間質與上皮細胞均有GnRH/GnRHR在mRNA和蛋白水平的表達，且這種表達呈動態(tài)變化模式，在分泌期時表達較強[19]。GnRH-Ⅱ在分泌早期和分泌中期的表達高于增殖期與分泌晚期[20]。GnRH/GnRHR系統在子宮內膜上表達的動態(tài)變化提示其參與了胚胎著床早期階段的“母胎對話”過程，并可能起到重要的調節(jié)作用[1，21]。

兩種類型的GnRH和GnRHR能通過相互特異性結合，降解子宮內膜間質的細胞外基質，提高蛻膜細胞的遷徙能力，是胚胎著床的關鍵[1]。此外，Wu等[22]一項最新研究表明，GnRH-Ⅱ激動劑可以通過與GnRHR-Ⅰ結合，調節(jié)基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9，增加尿激酶型纖溶酶原激活物的表達，從而增強子宮蛻膜間質細胞遷徙和侵入的潛能，促進蛻膜化過程，有利于胚胎著床。

當胚胎粘附并侵入子宮內膜間質后，滋養(yǎng)層細胞即分化為細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層，二者為早期胎盤的重要組成部分，均有GnRH/GnRHR系統表達。有研究表明，GnRH在妊娠早期(孕15周前)的表達穩(wěn)定在較高水平，與HCG分泌水平變化趨勢相符；GnRHR的表達量與HCG分泌呈正相關；胎盤組織體外培養(yǎng)時，GnRH可顯著增加胎盤組織中HCG的濃度。研究結果提示胎盤中GnRH/GnRHR系統在HCG合成與分泌過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[19]。

Lee等[17]利用體外培養(yǎng)建立的胚胎滋養(yǎng)細胞/蛻膜間質細胞系對GnRH/GnRHR系統在母胎交界面的作用進行了研究，結果顯示GnRH在不改變細胞因子分泌的基礎上，通過調節(jié)滋養(yǎng)層細胞HCG的分泌參與“母胎對話”，間接刺激卵巢分泌孕酮，起到黃體支持、維持早期妊娠的作用。另有研究報道，有流產史和既往HCG水平低下的女性體內存在GnRH抗體，佐證了GnRH/GnRHR系統在胚胎著床與胎盤形成中的重要作用[1]。

3. 參與卵巢的功能調節(jié)：GnRH/GnRHR在卵巢組織中的表達隨著卵泡發(fā)育階段不同呈現動態(tài)變化：始基卵泡至早期竇卵泡階段時尚不能檢測到其表達；在排卵前的卵泡中，主要表達于顆粒細胞層，膜細胞層僅有微弱表達；在黃體中，顆粒細胞層有顯著表達，膜細胞層則無表達[23]。GnRH/GnRHR系統在卵巢組織中這種階段性、空間特異性的表達方式，與之前文獻報道[11]類似。

GnRH/GnRHR系統通過自分泌/旁分泌途徑調控卵巢的分泌功能。研究表明，GnRH-a對卵泡顆粒細胞與黃體組織的雌、孕激素分泌起到雙重作用：小劑量的GnRH-a可顯著增加卵泡顆粒細胞雌激素的分泌，而大劑量的GnRH-a卻使雌激素濃度明顯下降；其對黃體組織孕酮分泌的影響也有類似效果[24-25]。

ART促排卵周期或自然周期中，在胚胎移植后黃體階段添加小劑量的GnRH-a，可能通過與黃體組織中顆粒細胞上的GnRHR結合刺激孕酮大量分泌，起到黃體支持作用。Tesarik等[25]研究認為，長方案或拮抗劑方案促排卵后行新鮮胚胎移植，黃體期給予GnRH-a能激發(fā)垂體釋放內源性LH并作用于卵巢，能在一定程度上逆轉降調所引起的內源性LH濃度及活性的下降，從而產生外源性HCG無法提供的生物學效應，為胚胎早期發(fā)育和妊娠維持提供有利環(huán)境。

三、GnRH-a在黃體支持中的臨床應用

GnRH/GnRHR系統在胚胎著床與早期發(fā)育中的重要作用還體現在ART的臨床實踐中，以避免促排卵引起的黃體功能不足導致的妊娠率下降。近年來GnRH-a已經被廣泛應用于ART周期的黃體支持中，其有效性得到了大樣本臨床研究的驗證。

2015年Cochrane圖書館發(fā)表的一份系統評價顯示，GnRH-a用于IVF/ICSI-ET助孕周期中的黃體支持能有效改善妊娠結局[26]。該研究納入了GnRH-a用于黃體支持的9項隨機對照試驗(RCT)，共包含2 861名患者，分為兩組進行比較：單純使用孕酮行黃體支持組(n=1 385)和聯合孕酮+GnRH-a行黃體支持組(n=1 476)；其中4項RCTs(n=1 386)采取單劑量注射GnRH-a，4項RCTs(n=1 175)采取多次給藥添加GnRH-a，另1項RCT(n=300)包含GnRH-a單劑量注射與多次給藥；在促排方案方面，6項RCTs采用長方案(n=2 045)，1項RCT采用拮抗劑方案(n=154)，1項RCT包含兩種促排方案(n=600)，另有1項RCT未注明促排方案(n=62)。該研究結果表明：不管是單劑量注射或多次給藥添加GnRH-a用于ART的黃體支持，均較單純使用孕酮顯著提高了活產率與持續(xù)妊娠率(OR=1.61，95%CI：1.23-2.08，I2=55%)；且與促排方案、孕酮使用方案無關；流產率、多胎妊娠率及卵巢過度刺激綜合癥(OHSS)發(fā)生率兩組比較無顯著性差異[26]。

綜合各個RCT研究者的討論觀點[27-29]，推測GnRH-a可能通過以下3種途徑影響胚胎著床與早期發(fā)育(圖1)：(1)直接作用于胚胎表面的GnRHR促進早期發(fā)育；(2)與子宮內膜上的GnRHR結合提高內膜容受性；(3)作用于卵巢黃體顆粒細胞上的GnRHR從而調節(jié)黃體功能。然而目前這些推測尚未得到研究證實，GnRH-a用于黃體支持改善妊娠結局的具體作用機制仍然存在爭議。

圖1　GnRH-a影響胚胎著床與早期發(fā)育的3種可能途徑

我院生殖中心對此設計并進行了一項臨床試驗，將人工周期準備內膜后行凍融胚胎移植(FET)的患者隨機分為兩組：試驗組和對照組，兩組均采用芬嗎通(Abbott，美國)口服+安琪坦(Besins，法國)陰道給藥的黃體支持方案，試驗組分別于移植日(F0)和移植后第3日(F3)添加達菲林(Ipsen，法國)0.1 mg皮下注射，目前兩組的入組患者均為39例，兩組妊娠率比較(33.3% vs. 35.9%)無顯著性差異(P=0.812)，考慮到樣本量偏小，該項試驗仍在進行中。

四、展望

眾多體外實驗與臨床研究均表明，GnRH/GnRHR系統在人類胚胎著床與早期發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。GnRH-a用于ART助孕治療ET后的黃體支持能改善妊娠結局，其有效性得到了循證證據的支持。但GnRH-a具體的作用機制尚需進一步探討；有關GnRH-a用于FET周期對妊娠結局影響的臨床證據尚不足，有待進一步觀察討論；且其安全性依然是值得關注的問題，需要多中心大樣本的臨床數據進行驗證和深入研究。

[1]Yu B，Ruman J，Christman G. The role of peripheral gonadotropin-releasing hormone receptors in female reproduction [J]. Fertil Steril，2011，95： 465-473.

[2]Kyrou D，Kolibianakis EM，Fatemi HM，et al. Increased live birth rates with GnRH agonist addition for luteal support in ICSI/IVF cycles： a systematic review and meta-analysis[J]. Hum Reprod Update，2011，17： 734-740.

[3]Oliveira JB，Baruffi R，Petersen CG，et al. Administration of single-dose GnRH agonist in the luteal phase in ICSI cycles： a meta-analysis[J]. Reprod Biol Endocrin，2010，8： 107.

[4]Martins WP，Ferriani RA，Navarro PA，et al. GnRH agonist during luteal phase in women undergoing assisted reproductive techniques： systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Ultrasound Obst Gyn，2016，47： 144-151.

[5]Qublan H，Amarin Z，Al-Quda M，et al. Luteal phase support with GnRH-a improves implantation and pregnancy rates in IVF cycles with endometrium of

[6]Lambalk CB，Homburg R. GnRH agonist for luteal support in IVF? Setting the balance between enthusiasm and caution[J]. Hum Reprod，2006，21： 2580-2582.

[7]Leung PC，Cheng CK，Zhu XM. Multi-factorial role of GnRH-I and GnRH-II in the human ovary[J]. Mol Cell Endocrinol，2003，202： 145-153.

[8]Chen A，Yahalom D，Laskar-Levy O，et al. Two isoforms of gonadotropin-releasing hormone are coexpressed in neuronal cell lines[J]. Endocrinology，2001，2： 830-837.

[9]Cheng CK，Leung PC. Molecular biology of gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-I，GnRH-II，and their receptors in humans[J]. Endocr Rev，2005，26： 283-306.

[10]Hislop JN，Madziva MT，Everest HM，et al. Desensitization and internalization of human and xenopus gonadotropin-releasing hormone receptors expressed in alphaT4 pituitary cells using recombinant adenovirus[J]. Endocrinology，2000，12： 4564-4575.

[11]Maggi R，Cariboni AM，Marelli MM，et al. GnRH and GnRH receptors in the pathophysiology of the human female reproductive system[J]. Hum Reprod Update，2015，22： pii： dmv059.

[12]Liu J，Maccalman CD，Wang YL，et al. Promotion of human trophoblasts invasion by gonadotropin-releasing hormone (GnRH) I and GnRH II via distinct signaling pathways[J]. Mol Endocrinol，2009，23： 1014-1021.

[13]Casan EM，Raga F，Polan ML. GnRH mRNA and protein expression in human preimplantation embryos[J]. Mol Hum Reprod，1999，5： 234-239.

[14]Dey SK，Lim H，Das SK，et al. Molecular cues to implantation[J]. Endocr Rev，2004，25： 341-373.

[15]Weimar CH，Post Uiterweer ED，Teklenburg G，et al. Reprint of： In-vitro model systems for the study of human embryo-endometrium interactions[J/OL]. Reprod Biomed Online，2013，27： 673-688.

[16]Thouas GA，Dominguez F，Green MP，et al. Soluble ligands and their receptors in human embryo development and implantation[J]. Endocr Rev，2015，36： 92-130.

[17]Lee HJ，Snegovskikh VV，Park JS，et al. Role of GnRH-GnRH receptor signaling at the maternal-fetal interface[J]. Fertil Steril，2010，94： 2680-2687.

[18]曹躍齡，張瓊芬，田維娟. GnRH類似物促進人早期胚胎體外發(fā)育能力的實驗研究[J]. 昆明醫(yī)學院學報，2009，30： 100-103.

[19]Raga F，Casan EM. Quantitative gonadotropin-releasing hormone gene expression and immunohistochemical localization in human endometrium throughout the menstrual cycle[J]. Biol Reprod，1998，59： 661-669.

[20]Cheon KW，Lee HS，Parhar IS，et al. Expression of the second isoform of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH-II) in human endometrium throughout the menstrual cycle[J]. Mol Hum Reprod，2001，7： 447-452.

[21]Klemmt PA，Liu F，Carver JG，et al. Effects of gonadotrophin releasing hormone analogues on human endometrial stromal cells and embryo invasion in vitro[J]. Hum Reprod，2009，24： 2187-2192.

[22]Wu HM，Huang HY，Lee CL，et al. Gonadotropin-releasing hormone type II (GnRH-II) agonist regulates the motility of human decidual endometrial stromal cells： possible effect on embryo implantation and pregnancy[J]. Biol Reprod，2015，92： 98.

[23]Choi JH，Gilks CB，Auersperg N，et al. Immunolocalization of gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-I，GnRH-II，and type I GnRH receptor during follicular development in the human ovary[J]. J Clin Endocrinol Metab，2006，91： 4562-4570.

[24]Choi KC，Auersperg N，Leung PC. Expression and antiproliferative effect of a second form of gonadotropin-releasing hormone in normal and neoplastic ovarian surface epithelial cells[J]. J Clin Endocrinol Metab，2001，10： 5075-5078.

[25]Tesarik J，Hazout A，Mendoza-Tesarik R，et al. Beneficial effect of luteal-phase GnRH agonist administration on embryo implantation after ICSI in both GnRH agonist-and antagonist-treated ovarian stimulation cycles[J]. Hum Reprod，2006，21： 2572-2579.

[26]van der Linden M，Buckingham K，Farquhar C，et al. Luteal phase support for assisted reproduction cycles[J]. Cochrane Database Syst Rev，2015，7：CD009154.

[27]Inamdar DB，Majumdar A. Evaluation of the impact of gonadotropin-releasing hormone agonist as an adjuvant in luteal-phase support on IVF outcome[J]. J Hum Reprod Sci，2012，5： 279-284.

[29]Aboulghar MA，Marie H，Amin YM，et al. GnRH agonist plus vaginal progesterone for luteal phase support in ICSI cycles： a randomized study[J/OL]. Reprod Biomed Online，2015，30： 52-56.

[編輯：辛玲]

Role of GnRH and its receptor in human embryo implantation and early development

LI Ying，FENG Yun*

ReproductiveMedicineCenterofRuijinHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200025

GnRH and GnRH receptor (GnRHR) play a key role in regulation of human reproduction，implantation and early development of embryos. GnRH not only plays an important role in regulating reproductive function and endocrine balance through the hypothalamus-pituitary-gonad axis，but also produces direct effects through combination of GnRHR located in the ovary，endometrium，placenta and embryo for comprehensive regulation of embryo implantation and early development process. GnRH agonist (GnRH-a) is currently widely used in controlled ovarian hyperstimulation，it is also beneficial to the pregnancy process in luteal support stage besides the effect of down regulation. The applications of GnRH/GnRHR and GnRH-a in embryonic development and assisted reproduction were reviewed in this article.

GnRH；GnRHR；Embryo implantation；Early embryo development；Luteal support

2016-02-18；

2016-03-12

李穎，女，河南人，博士研究生，生殖醫(yī)學專業(yè).(*

，Email：artruijin@163.com)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.021