填精補(bǔ)腦方對(duì)老年癡呆大鼠行為學(xué)及海馬膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響*

王愛(ài)梅

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填精補(bǔ)腦方對(duì)老年癡呆大鼠行為學(xué)及海馬膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響*

王愛(ài)梅

目的觀察填精補(bǔ)腦方對(duì)老年癡呆大鼠行為學(xué)及海馬膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法健康成年SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、腦復(fù)康組、填精補(bǔ)腦方組，每組10只。雙側(cè)海馬注射Aβ25-35構(gòu)建老年癡呆大鼠模型，各組給予相應(yīng)藥物灌胃治療20 d。用藥結(jié)束后，測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及海馬ChAT、AChE的酶學(xué)活性。結(jié)果與模型組相比，用藥組達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)明顯減少(P<0.01)；ChAT活性升高，AChE活性降低(P<0.01)。結(jié)論填精補(bǔ)腦方可以改善老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制可能與改善海馬中膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的代謝有關(guān)。

填精補(bǔ)腦方；老年癡呆；學(xué)習(xí)記憶；ChAT；AChE

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病 (Alzheimer，s disease, AD)，是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。隨著老齡化社會(huì)步伐的加快，探索AD的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療藥物已成為廣大科研和臨床工作者的關(guān)注重點(diǎn)，中醫(yī)藥在老年癡呆病的預(yù)防、治療、保健康復(fù)等方面有顯著的優(yōu)勢(shì)。膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與運(yùn)動(dòng)、情感和認(rèn)知等眾多生理過(guò)程，與大腦的學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知能力之間有密切關(guān)系[1,2]。本實(shí)驗(yàn)以雙側(cè)海馬注射Aβ25-35方法構(gòu)建老年癡呆大鼠模型，通過(guò)觀察填精補(bǔ)腦方對(duì)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬中膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，進(jìn)而探討其作用機(jī)制，為臨床治療老年癡呆提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年SD大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(220±20)g，雌雄各半，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 (許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002)。

1.2主要儀器與試劑腦立體定位儀，成都儀器廠；MG-3Y迷宮刺激器，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；V-1200型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱譜儀器儀表有限公司；FSH-Ⅱ型高速電動(dòng)勻漿機(jī)，江蘇金運(yùn)市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；Aβ25-35，美國(guó)Sigma試劑公司，批號(hào)A4559；填精補(bǔ)腦方藥物，河南省南陽(yáng)市醫(yī)藥公司；腦復(fù)康(吡拉西坦片)，湖北華中藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130922；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶試劑盒和乙酰膽堿酯酶試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20130920，20130911。

1.3填精補(bǔ)腦方的制備取熟地黃20 g，黃精20 g，三七參10 g，川芎15 g，鹿茸10 g，山萸肉20 g，靈芝15 g，天麻15 g，制何首烏15 g，加入6倍量水煎煮2次，合并水煎液，配制成2 g/ml的藥液，高壓滅菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4模型制備及給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、腦復(fù)康組、填精補(bǔ)腦方組，每組10只。各組大鼠經(jīng)腹腔注射10% 水合氯醛 (0.3 ml/100 g) 麻醉后，固定于腦立體定位儀上，參照Paxinos大鼠腦立體定位圖譜[3]，由Bergam點(diǎn)向后3.2 mm，中線旁2.2 mm，用骨鉆鉆透雙側(cè)顱骨，在腦立體定位儀引導(dǎo)下，微量注射器垂直進(jìn)針4 mm，模型組及給藥組緩慢注入雙側(cè)海馬組織內(nèi)4 μl的Aβ25-35溶液緩慢(每側(cè)2 μl)，對(duì)照組注入等體積無(wú)菌生理鹽水。術(shù)后次日腦復(fù)康組、填精補(bǔ)腦方組分別給予腦復(fù)康(40 mg/ml)及填精補(bǔ)腦方(2 g/ml)灌胃，各組動(dòng)物按1 ml/100 g給藥，對(duì)照組和模型組每天給予1 ml/100 g的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)20 d。各組動(dòng)物每周記錄一次體質(zhì)量，調(diào)整注射劑量。

1.5大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定(Y 迷宮法)參照楊偉文章[4]記錄大鼠達(dá)標(biāo)所需的訓(xùn)練次數(shù)，作為大鼠學(xué)習(xí)能力的觀測(cè)指標(biāo)。學(xué)習(xí)能力測(cè)試24 h后，觀察大鼠在 30 次測(cè)試反應(yīng)中的錯(cuò)誤次數(shù)，將其作為記憶能力檢測(cè)的指標(biāo)。

1.6海馬ChAT、AChE的檢測(cè)最后一次Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，斷頭處死大鼠，取大鼠海馬組織，按照試劑盒要求進(jìn)行ChAT、AChE的檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較與對(duì)照組比較，模型組達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，腦復(fù)康組、填精補(bǔ)腦方組達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)明顯減少(P<0.01)，兩組之間差異不明顯(P>0.05，表1)。表明填精補(bǔ)腦方可以改善老年癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.2填精補(bǔ)腦方對(duì)老年癡呆大鼠海馬ChAT、AChE活性的影響與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬中ChAT活性明顯下降，AChE活性明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，用藥物組大鼠海馬中ChAT活性明顯升高，AChE活性明顯降低(P<0.01)。腦復(fù)康組、填精補(bǔ)腦方組之間上述指標(biāo)沒(méi)有明顯改變(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠Y迷宮及海馬ChAT、AChE活性檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較1)P<0.01；與模型組比較2)P<0.01

3　討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，AD的發(fā)病機(jī)制是由于腎精虧損，腦髓失養(yǎng)、瘀血阻絡(luò)所致。填精補(bǔ)腦方藥物以補(bǔ)血滋陰，益精填髓，健脾益腎，活血祛瘀為主，符合AD的治療理論。AD因腦萎縮導(dǎo)致認(rèn)知功能下降、記憶力嚴(yán)重減退，智力下降、注意力無(wú)法集中等臨床表現(xiàn)，因此在AD的診斷和治療評(píng)價(jià)中，學(xué)習(xí)記憶水平是最重要的指標(biāo)[5]。本實(shí)驗(yàn)Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)明顯增多；腦復(fù)康組、填精補(bǔ)腦方組達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)明顯減少，表明填精補(bǔ)腦方可以改善老年癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

膽堿功能低下假說(shuō)認(rèn)為[6,7]：中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶之間有重要聯(lián)系，膽堿能神經(jīng)元缺失導(dǎo)致腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)ACh的減少，是AD學(xué)習(xí)記憶障礙的重要機(jī)制。AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能神經(jīng)功能明顯下降，且下降程度和AD的臨床癥狀嚴(yán)重程度密切相關(guān)。ChAT是合成ACh的關(guān)鍵酶，AChE是降解ACh的關(guān)鍵酶。ChAT和AChE的活性與腦內(nèi)ACh的含量密切相關(guān)，兩者共同維持了ACh含量的動(dòng)態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬中ChAT活性明顯下降，AChE活性明顯增加。與模型組相比，用藥物組大鼠海馬中ChAT活性明顯升高，AChE活性明顯降低。這表明填精補(bǔ)腦方可以提高老年癡呆模型大鼠海馬中ChAT活性，抑制AChE活性，從而增加海馬中ACh的含量，在改善學(xué)習(xí)記憶功能方面發(fā)揮一定的作用。

綜上所述，填精補(bǔ)腦方對(duì)老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能具有改善作用，其機(jī)制可能與改善海馬中膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的代謝有關(guān)。

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河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(132102310263)

河南南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校(南陽(yáng) 473061)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.13.021

1003-8914(2016)-13-1882-02

(本文校對(duì)：李弋2015-12-02)