文蛤抗腫瘤蛋白M ere15的表達純化及鑒定

喬淦

（青島科技大學化工學院，山東青島　266042）

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文蛤抗腫瘤蛋白M ere15的表達純化及鑒定

喬淦

（青島科技大學化工學院，山東青島266042）

抗腫瘤蛋白Mere15是從海洋生物文蛤中獲得的抗腫瘤多肽。前期研究表明，Mere15具有顯著的體內外抗腫瘤活性，但其在文蛤體液中含量極低。利用簡并引物技術克隆了Mere15的全基因序列，并在大腸桿菌中獲得高效表達。利用親和層析技術純化目的蛋白，經透析除去鹽和超濾濃縮，獲得Mere融合蛋白，SDS-PAGE分析表明，目的蛋白分子量為33 kDa。MTT結果表明，目的蛋白對多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，為海洋抗腫瘤蛋白研究提供了新的思路，對抗腫瘤新藥Mere15的開發應用也有一定的價值。

文蛤；抗腫瘤多肽；重組表達；細胞毒活性

文蛤（Meretrix meretrix） 作為一味傳統中藥，在《傷寒雜病論》及《百草綱目》等記載文蛤具有活血化瘀、防寒止痛的功效。目前，從文蛤分離的化合物有多糖、糖肽、脂質、牛磺酸、多肽等［1-7］；文蛤提取物具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗炎、增強免疫等生物活性［2，8-17］。文蛤多肽類的抗癌活性研究中，范成成等人［18］提取的一種文蛤多肽Mer2具有廣譜的癌細胞抑制活性，調控癌細胞的凋亡、抑制癌細胞的生長。在本試驗前期分離的1種文蛤多肽Mere15［19］，通過多通路誘導肺癌細胞A549凋亡文蛤多肽抑制腫瘤細胞微管蛋白聚合。Mere15可以抑制微管蛋白的聚合，調控細胞周期蛋白的表達，阻滯細胞周期的正常發生，在多肽作用下肺癌細胞在G2/M時期停滯，抑制肺癌細胞的生長并促進細胞凋亡。

本試驗通過對Mere15多肽進行Edama降解法測序，測得一段序列。通過簡并引物技術克隆了Mere15相關基因，構建工程菌，表達Mere15融合多肽，并研究了其對癌細胞的細胞毒作用。

1　材料與方法

1.1材料

文蛤，購買自青島河套海洋漁業發展有限公司；克隆載體Puc-19和表達載體Pet-28a，均購買自大連Takara公司；感受態菌株Top10和表達菌株BL21，均購買自全式金生物公司；總RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、Fast HiFidelity PCR Kit聚合酶、膠回收試劑盒，均購買自北京天根生化科技有限公司；限制性內切酶、連接酶，均購買自NEB；反轉錄試劑盒、PCR試劑，均購買自Takara公司；PVDF膜，購自Milipore；抗-His抗體、羊抗鼠二抗及DNA Mark2000，均購買自碧云天生物技術有限公司；5 mLNi-NTA His Bind column，購買自GE公司；透析袋，購買自Sigama公司；其他常用化學用品均購買自國藥集團。

1.2方法

1.2.1抗腫瘤多肽Mere15基因克隆

Mere15 N端序列測定采用Edama降解法，由上海生工公司完成。文蛤總RNA提取，使用1 mL TRIZOL buffer處理文蛤組織，然后離心分離，按照試劑盒說明進行操作，最終使用TE buffer重懸RNA。以RNA模板合成cDNA，反應體系參數按照反轉錄試劑說明書進行，反應條件為42℃，15 min；85℃，30 s終止試驗。Mere15基因合成使用簡并引物技術，根據Mere15多肽序列比對分析結果，使用CODEHOP軟件設計簡并引物［20-21］。

M1：5'CGCCGAATTCATGGTNGTNTGYCCNGAY G3'；

M2：5'CCGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'

（R=A+G；Y=T+C；N=A+T+C+G；）

引物由上海生工合成，EcoRI及HindIII雙酶作為酶切設計用于載體構建。Mere15基因克隆以cDNA為模板，反應體系按照PCR反應說明書要求進行，反應條件按照Perkin Elmer的方法：94℃，2 min；94℃，15 s，58℃，10 s，68℃，30 s，共35個循環；68℃延伸5 min，獲得Mere15基因全長序列。將獲得條帶經膠回收，純化得到目的基因片段。

1.2.2表達載體構建

將目的基因與T載體（PUC19-Mere15），試驗方法按照載體說明書操作。構建好的克隆質粒轉染大腸桿菌DH5α，進行質粒擴增，采用膠回收的方法純化PUC18-Mere15質粒，測序驗證后將目的基因插入表達載體PET28，獲得表達載體成PET28-Mere15。

1.2.3Mere15融合蛋白誘導表達與純化

使用Ni離子親和柱（GE，Ni-NTA His Bind column）純化Mere15融合蛋白。PET28-Mere15質粒轉化BL21宿主菌，接種重組子在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基中篩選陽性克隆，培養過夜。接種陽性重組子至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基，待菌體生長至對數期（OD=0.8）左右，使用1 m MIPTG，37℃，220 r/min誘導目的蛋白表達，4 h后高速離心收集菌體。使用100 mLLysis buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH值8.0） 重懸菌體，加入1 mmol/L苯甲基磺醯化氟、1%NP40及適量溶菌酶，進行超聲破碎細胞（工作2 s，暫停1 s），至細胞完全破碎，然后高速離心（12 000 r/min，10 min），取上清。經Ni離子親和柱親和純化，上樣過程中收集穿透液（如圖2 A1），后使用15 mL Washing buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，pH值8.0）洗脫并收集雜蛋白（如圖2 A2）。使用20mL Elution buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L imidazole，pH值8.0）洗脫并收集目的蛋白（如圖2 A3），然后使用SDS-PAGE鑒定蛋白表達純化。

1.2.4Mere15融合蛋白鑒定

取適量目的蛋白，使用15%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉至0.45 μm PVDF膜，后使用5%小牛血清封閉PVDF膜1 h后，加入適量HIS抗體稀釋液（1∶1 000），4℃層析柜中孵育過夜，TBST（19 mmol/L Tris-HCl，2.7 mmol/L KCl，137 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20，pH值8.0）緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次5 min，然后加入適量過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h后，使用TBST漂洗膜3次，每次5 min。使用ECL化學發光的方法檢測融合蛋白印跡。

1.2.5MTT法測定細胞抑制率

取對數期細胞A549及PNC28，然后細胞密度稀釋至2×104個，按照每孔190 μL接種于96孔板，培養24 h；然后加入10 μL的重組蛋白，按照20，40，80，160 μg/mL的最終濃度加入各孔，空白組加入10 μL培養基，每組設3個復孔。置于5%CO2，37℃條件下培養24 h，然后在顯微鏡下觀察細胞形態并記錄，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）。放入細胞培養箱中4 h后，棄去培養基，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），水平振蕩10 min；然后使用酶標儀測定各孔于570 nm處吸光度，每組取平均值計算多肽對細胞的抑制活性。

2　結果與分析

2.1目的基因鑒定

分子印跡檢測見圖1。

圖1　分子印跡檢測

使用簡并引物技術擴增目的基因，根據Mere多肽的N端序列，經數據庫Blast比對得到Mere同源蛋白序列，然后根據簡并引物設計原則克隆目的基因。目的基因擴增結果如圖1 A所示，目的基因片段在850 bp左右，通過比對PET-Mere15序列與Mere15蛋白測序結果，確定其序列一致，重組子構建符合設計。PUC19-Mere15載體的雙酶切如圖1 B，表達載體PET28-Mere15的雙酶切凝膠如圖1 C，目的基因在850 bp左右，和克隆基因的分子大小一致，符合預測值。而天然分離的Mere15分子大小在15 kDa左右，融合的大小則為33 kDa。理論上，融合蛋白只增加了6個組氨酸標簽并沒有改變蛋白序列，蛋白之間差異可能是Mere15 RNA剪接發生而產生分子量不同的蛋白。

2.2Mere15多肽表達純化

蛋白純化系統純化過程1，2，3樣品吸光度見圖2，3樣品SDS-PAGE結果見圖3，免疫印跡蛋白見圖4。

圖2　蛋白純化系統純化過程1，2，3樣品吸光度

圖3　3樣品SD S-PAG E結果

圖4　免疫印跡蛋白

結果表明，目的蛋白主要存在于包涵體中，超聲破碎包涵體以獲得目的蛋白。使用Ni離子柱對目的蛋白進行親和純化，蛋白純化流程如圖2，其中穿透液（1）、雜蛋白洗脫液（2）、目的蛋白洗脫液（3）。由圖3可知，目的蛋白的分子大小在33 kDa左右，和預計結果一致。從結果中可以看出，目的組分中有少許雜蛋白，但目的產物純度為95%以上，雜蛋白對蛋白影響較小，目的蛋白可以用于細胞活性測定。由圖4可知，在33 kDa大小左右有1條明顯印跡條帶，說明有融合蛋白成功表達。使用超濾設備對目的蛋白濃縮除鹽，最終使用PBS緩沖溶液稀釋Mere15融合蛋白至5 mg/mL。

2.3重組蛋白對腫瘤細胞生長的抑制作用

24 h后A549細胞形態變化見圖5，24 h后PNC28細胞形態變化見圖6。

圖5　24 h后A549細胞形態變化

圖6　24 h后PN C 28細胞形態變化

采用MTT法測定了重組蛋白對A549及PNC28生長的抑制作用，蛋白多肽對2種細胞的抑制活性在160 μg/mL質量濃度下抑制率分別為43.7%，44.6%。在多肽處理24 h后，顯微鏡下觀察細胞形態如圖5和圖6，空白組的細胞形態呈緊密排列，狀態良好，而隨著蛋白質量濃度的升高，細胞的形態出現了變化，多肽質量濃度越高細胞狀態變化越大。細胞由規則的形態逐漸變化為體積縮小直至成為細胞碎片，細胞胞漿固縮并出現明顯的空泡狀結構。細胞之間的空隙逐漸增大，貼壁能力變弱，呈現一定的凋亡特征，說明多肽對癌細胞具有一定的抑制作用。多肽的抑制活性隨著蛋白質量濃度梯度增加，說明藥物活性和多肽質量濃度有較強的依賴關系。

3　討論

多肽生物活性的研究中，多數多肽表現出一定的抗腫瘤活性，如趙進［22］發現的海鞘多肽CS5931，通過作用于細胞表面的烯醇化酶（Enolase） 相互作用，抑制Enolase的活性，從而抑制癌細胞的正常代謝功能，誘導細胞凋亡。阮之平等人［23］分離出一種蟾蜍多肽的試驗表明，蟾蜍活性多肽可能通過下調周期相關基因cyclin B，CDK1的表達阻滯腫瘤細胞周期于G2/M期檢查點。對凋亡誘導的作用可能與凋亡相關基因Survivin，Caspase-3表達和bcl/bak表達的比值上調有關。另外，莊海峰等人［24］分離的一種蝎毒多肽對急性淋巴癌細胞的研究中，結果表明蝎毒多肽可有效抑制HL-60細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，其機制可能是多肽參與HL-60細胞內p53基因的表達調控，抑制Bcl-2基因的表達有關。

Mere15是一種從文蛤分離天然多肽，在前期研究中文蛤多肽具有靶向調控肺癌細胞凋亡的作用，在Mere15多肽處理癌細胞后，細胞周期停滯在G2/M期，阻滯細胞周期的正常發生，并通過調控細胞周期蛋白p21的表達及抑制微管蛋白的聚合，從而抑制細胞正常代謝及有絲分裂功能，促進細胞凋亡的發生。本試驗中克隆的Mere15相關基因約為使用原核表達的方法得到Mere15的融合蛋白，Mere融合蛋白大小約為33 kDa左右，與分離的天然文蛤蛋白Mere15分子量有一定差異，分離的 Mere多肽在45 μg/mL的抑制活性為77%，而表達的融合蛋白細胞活性（43.6%）降低，產生這個結果的原因可能是融合蛋白的分子量較大，蛋白的結構改變掩蓋了蛋白的活性位點。天然多肽可能是由融合多肽基因剪接而得到的一種小分子多肽。目前的試驗表明，大分子Mere15融合多肽具有一定的抑癌活性，下一階段將對融合蛋白的基因截取小片段后再融合表達，通過研究小片段多肽活性及機制，尋找抗癌藥物的新靶點。

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Cloning Experession and Cytotoxicity of Antitumor Protein from Meretrix Meretrix

QIAO Gan
（Colege of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao，Shandong 266042，China）

In the precious study，an antitumor protein，called Mere15 is isolated form Meretrix meretrix.The polypeptide could effectively inhibit the cancer proliferation both in vitro and in vivo.However，the content of the polypeptide in the species is very low.In the present study，the cDNA sequence is cloned and the polypeptide is expressed in E.coli.The antitumor protein is purified to homogeneity with molecular 33 kDa.MTT assay revealed that the recombinant protein displayed potent cytotoxicity to several cancer cells.The study develop an novel strategy for the production of antitumor protein from marine organisms，and the work is also important for developing Mere15 as an novel anticancer agent.

Meretrix meretrix；anticancer protein；cloning and expression；cytotoxicity

G420

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.013

1671-9646（2016）07a-0044-04

2016-05-09

國家自然科學基金（81573457）。

喬淦（1989— ），男，碩士，研究方向為生物藥物。