乙醇對大鼠不同臟器微動脈的作用及其機制研究

李亞君，劉　宇，牛龍剛，楊逸童，張明升

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乙醇對大鼠不同臟器微動脈的作用及其機制研究

李亞君，劉宇，牛龍剛，楊逸童，張明升

目的觀察不同預收縮劑基礎上乙醇對大鼠不同臟器微動脈的作用及其機制的研究。方法采用PowerLab Chart和DMT微血管環張力記錄系統，觀察靜息狀態及不同預收縮劑(0.3 μmol/L U46619、39 mmol/L KCl、0.000 3 μmol/L ET)基礎上乙醇對大鼠不同臟器微動脈環的收縮作用并比較其差異性；觀察不同激酶抑制劑SB239063、PD98059、Y27632對乙醇所致的冠狀動脈環收縮作用的影響；觀察鈣通道阻斷劑硝苯地平對乙醇所致的大腦中動脈環收縮作用的影響。結果靜息狀態下，0.1%、0.3%、1%濃度的乙醇對大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環的靜息張力無明顯作用；在不同的預收縮劑基礎上，乙醇對大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環有濃度依賴性的收縮作用；在預孵不同激酶抑制劑后，對于不同濃度的乙醇所致冠狀動脈環的收縮有不同程度的抑制作用；鈣通道阻斷劑硝苯地平可以抑制乙醇所致大腦中動脈環的收縮作用。結論在預收縮劑基礎上，乙醇對大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈具有濃度依賴性的收縮作用，該收縮作用可能與絲裂原活化蛋白激酶、Rho激酶和鈣通道有關。

微動脈；乙醇；激酶；鈣通道；血管平滑肌

酒主要成分是乙醇，隨著生活水平的提高，全球飲酒人數呈遞增趨勢，而乙醇對人類健康的影響也受到越來越多的關注，作為心腦血管疾病的誘因之一，乙醇已成為近年來研究的熱點。已有研究證明適量飲酒可以降低冠心病的死亡率[1-2]，在高血壓的模型大鼠中，低劑量的乙醇可以降低血壓[3]；乙醇可以引起家兔胸主動脈舒張，而這種舒張作用可能與血管平滑肌細胞肌質網Ca2+的釋放和胞外Ca2+的內流有關[4]。前期研究表明：長期大量飲酒可以改變大鼠冠狀動脈肌源性的反應，表現出對硝普鈉和吡那地爾舒張作用的減弱，對血栓素A2(TXA2)受體激動劑U46619、K-IR通道抑制劑BaCl2、K-Ca通道抑制劑四乙胺(TEA)的收縮反應敏感性增加[5]，但缺乏急性酒精的刺激對大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環影響的研究。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中p38MAPK與血管舒縮反應的調節有著密切的關系，其抑制劑SB239063能在磷酸化水平阻斷生物信號轉導；細胞外信號調節激酶(ERK)在血管的發生發展過程中發揮重要的作用[6]，其抑制劑PD98059可以抑制ERK的上游激酶MEK；Rho激酶與細胞有絲分裂、骨架調整、細胞收縮等一系列生命活動現象有關，Y27632是選擇性的Rho激酶抑制劑，通過與GTP結合競爭性的抑制Rho激酶的活性[7]，使平滑肌松弛。乙醇引起的冠狀動脈環的收縮是否與以上激酶有關，國內外尚未見報道。

鈣通道普遍存在于各種組織中，是控制細胞外Ca2+跨膜內流的主要途徑，胞外Ca2+的內流是興奮-收縮耦聯和興奮-分泌耦聯的關鍵環節，而對于乙醇引起的大腦中動脈環的收縮與Ca2+有無關系，需要進一步的證明。

本實驗擬采用離體血管環的實驗方法，觀察在靜息狀態下乙醇對大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈肌源性的反應；在不同預收縮劑基礎上，乙醇對各微動脈的收縮作用及其差異性；在預收縮基礎上，SB239063、PD98059、Y27632對乙醇引起的冠狀動脈環收縮作用的影響；在預收縮基礎上，硝苯地平對乙醇引起的大腦中動脈環收縮作用的影響。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑乙醇購自天津市大茂化學試劑廠，TXA2受體激動劑U46619、內皮素(ET)、SB239063、PD98059、Y27632均購自Sigma公司。正常生理平衡液PSS： NaCl 144 mmol/L，KCl 5.8 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，HEPES 5 mmol/L；含60 mmol/L KCl PSS：NaCl 89.8 mmol/L，KCl 60 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，HEPES 5 mmol/L；含39 mmol/L KCl PSS：NaCl 110.8 mmol/L，KCl 39 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，HEPES 5 mmol/L，試劑均為市售分析純。

1.2實驗動物健康雄性SD大鼠，體重220 g～250 g，3個月齡，購自山西醫科大學實驗動物中心，在藥理教研室動物房喂養2周后方可進行實驗。

1.3實驗儀器與設備離體微血管環張力測定儀，購自丹麥DMT公司；PowerLab Chart 生物信號采集記錄系統，購自澳大利亞 AD 儀器；恒溫水浴箱，購自成都泰盟科技有限公司；體視顯微鏡，購自江西鳳凰體視顯微鏡XTL-165-VT連續變倍45×/90×/180×；PHS-3C pH 計，購自上海雷磁公司；賽多利斯 BS 124 S 精密電子天平，購自德國 Sartorius 公司；顯微外科手術器械，購自上海醫療器械(集團)有限公司。

1.4離體微動脈環的制備取大鼠，斷頭處死，立即取出心臟置于4 ℃的PSS液中，迅速擠壓心臟，直至液體清亮無血；打開腹腔，沿腹主動脈取出兩側腎臟；打開顱骨，在頭顱下輕輕取出大腦組織；取出的組織均放在提前在冰箱中預冷的PSS液中以備用。在顯微鏡下，用顯微器械輕輕剖離周圍組織，分別分離出大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈，將游離的動脈剪成2 mm長的動脈環，放入含有5 mL預冷的PSS液浴槽中，并用鋼絲固定在DMT傳感器上。

1.5實驗方法①動脈環在浴槽中維持1 h，在此過程中，持續通入100%的氧氣并給予恒溫，每隔15 min用恒溫的PSS液更換1次，在實驗開始前，用含有60 mmol/L KCl的PSS液連續刺激血管，當兩次血管收縮幅度相差不超過10%時，認為血管反應良好，可正式開始實驗。②靜息狀態下，在正常的PSS液中累計加入0.1%、0.3%、1%的乙醇，觀察不同濃度乙醇對大鼠微動脈環張力的影響。③在不同的預收縮劑(0.3 μmol/L U46619、39 mmol/L KCl、0.000 3 μmol/L ET)基礎上，觀察不同濃度乙醇對大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環張力的影響，并比較其有無組織間差異性。以60 mmol/L KCl對微動脈的收縮幅度為100%，計算在不同預收縮劑基礎上不同濃度乙醇對微動脈環的收縮幅度。④在0.3 μmol/L U46619預收縮基礎上，預孵不同激酶抑制劑SB239063、PD98059、Y27632，觀察不同激酶抑制劑對不同濃度乙醇所致的冠狀動脈環收縮作用的影響，以60 mmol/L KCl對冠狀動脈環的收縮幅度為100%，計算預孵不同激酶抑制劑后，不同濃度乙醇對冠狀動脈環的收縮幅度。⑤在0.3 μmol/L U46619預收縮基礎上，預孵硝苯地平，觀察對不同濃度乙醇所致的大腦中動脈環收縮作用的影響，以60 mmol/L KCl對大腦中動脈環的收縮幅度為100%，計算預孵硝苯地平后，不同濃度乙醇對大腦中動脈環的收縮幅度。

2　結　果

2.1不同濃度乙醇對大鼠微動脈環靜息張力的影響在靜息狀態下，向浴槽中累計加入0.1%、0.3%、1%的乙醇，對大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環的張力并沒有顯著的影響。

2.2在U46619(0.3 μmol/L)預收縮基礎上乙醇對微動脈的收縮作用在U46619 (0.3 μmol/L)預收縮基礎上，大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環的張力隨著乙醇濃度(0.1%、0.3%、1%)的升高而增高。以60 mmol/L KCl對各微動脈的收縮幅度為100%，在U46619預收縮基礎上，不同濃度乙醇對大鼠冠狀動脈環的收縮幅度分別為(8.34±1.78)%、(28.76±2.99)%、(78.27±17.11)%，對腎動脈環的收縮幅度分別為(6.46±1.37)%、(12.43±3.19)%、(37.81±6.99)%，對大腦中動脈環的收縮幅度分別為(11.46±3.40)%、(33.41±8.49)%、(87.93±8.40)% 。以乙醇對冠狀動脈環的收縮幅度為對照組，0.3%、1%的乙醇在0.3 μmol/L U46619預收縮基礎上對腎動脈環的收縮差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

注：與對照組比較，★P<0.05。

2.3在KCl(39 mmol/L)預收縮基礎上乙醇對微動脈環的收縮作用在39 mmol/L KCl的預收縮基礎上，大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環的張力隨著乙醇濃度(0.1%、0.3%、1%)的增高而增高，以60 mmol/L KCl 對微動脈的收縮幅度為100%，在KCl預收縮基礎上，不同濃度乙醇對大鼠冠狀動脈環的收縮幅度分別為(5.93±0.87)%、(17.50±4.42)%、(36.74±2.02)%。對腎動脈環的收縮幅度分別為(3.03±2.28)%、(9.52±4.55)%、(25.16±2.26)%。對大腦中動脈環的收縮幅度分別是(2.79±0.75)%、(16.32±5.61)%、(41.55±7.84)%。以乙醇對冠狀動脈環的收縮幅度為對照組，在39 mmol/L KCl預收縮基礎上，0.3%、1%的乙醇對腎動脈環的收縮幅度與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，0.1%的乙醇對大腦中動脈環的收縮幅度與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

注：與對照組比較，★P<0.05。

2.4在ET(0.000 3 μmol/L)預收縮基礎上乙醇對微動脈的收縮作用在0.000 3 μmol/L ET 的預收縮基礎上，大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環的張力隨著乙醇濃度(0.1%、0.3%、1%)的增高而增高，以60 mmol/L KCl對微動脈的收縮幅度為100%，在ET預收縮基礎上，不同濃度乙醇對大鼠冠狀動脈的收縮幅度分別為(9.36±4.02)%、(19.08±7.91)%、(63.05±8.58)%，對腎動脈環的收縮幅度分別為(3.65±1.46)%、(11.98±3.32)%、(26.69±5.77)%，對大腦中動脈環的收縮幅度分別為(11.00±1.97)%、(25.86±5.76)%、(60.91±6.13)%。以乙醇對冠狀動脈環的收縮幅度為對照組，在0.000 3 μmol/L ET預收縮基礎上，0.1%、1%的乙醇對腎動脈環的收縮幅度與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

注：與對照組比較，★P<0.05。

2.5SB239063對U46619(0.3 μmol/L)預收縮基礎上不同濃度乙醇所致的冠狀動脈環收縮作用的影響以60 mmol/L KCl對冠狀動脈環的收縮幅度為100%，在0.3 μmol/L U46619預收縮基礎上，0.1%、0.3%、1%的乙醇所致冠狀動脈環的收縮幅度分別為(10.92±6.41)%、(24.87±5.38)%、(70.97±22.57)%，預孵3μmol/LSB239063時，可以抑制0.3%乙醇對冠狀動脈環的收縮(P<0.05)，其收縮百分比為(10.16±7.06)%。SB239063對0.1%、1%乙醇所致冠狀動脈環的收縮無顯著影響。詳見圖4。

注：與對照組比較，★P<0.05。

圖4SB239063對U46619預收縮基礎上不同濃度乙醇所致冠狀動脈環收縮作用的影響

2.6PD98059對U46619(0.3 μmol/L)預收縮基礎上不同濃度乙醇所致冠狀動脈環收縮作用的影響 以60 mmol/L KCl對冠狀動脈環的收縮幅度為100%，在0.3 μmol/L U46619預收縮基礎上，0.1%、0.3%、1%的乙醇所致冠狀動脈環的收縮幅度分別為(9.54±7.59)%、(23.12±13.77)%、(51.17±17.86)%，預孵3 μmol/L PD98059時，可以抑制0.1%、0.3%乙醇對冠狀動脈環的收縮作用(P<0.05)，其收縮百分比分別為(0.25±3.08)%、(4.24±8.45)%，PD98059對1%乙醇所致冠狀動脈環的收縮無顯著影響。詳見圖5。

注：與對照組比較，★P<0.05。

圖5PD98059對U46619預收縮基礎上不同濃度乙醇所致冠狀動脈環收縮作用的影響

2.7Y27632對U46619(0.3 μmol/L)預收縮基礎上不同濃度乙醇所致冠狀動脈環收縮作用的影響以60 mmol/L KCl對冠狀動脈環的收縮幅度為100%，在0.3 μmol/L U46619預收縮基礎上，0.1%、0.3%、1%的乙醇對冠狀動脈環的收縮幅度分別為(7.10±2.52)%、(28.46±18.49)%、(68.34±12.07)%。預孵1 μmol/L Y27632時，可以抑制0.1%、1%的乙醇對冠狀動脈環的收縮作用(P<0.05)，其收縮百分比分別為(0.61±0.20)%、(33.33±12.49)%，Y27632對0.3%乙醇所致冠狀動脈環的收縮無顯著影響。詳見圖6。

注：與對照組比較，★P<0.05。

圖6Y27632對U46619預收縮基礎上不同濃度乙醇所致冠狀動脈環收縮作用的影響

2.8硝苯地平對U46619預收縮基礎上乙醇所致的大腦中動脈環收縮作用的影響以60 mmol/L KCl對大腦中動脈環的收縮幅度為100%，在0.3 μmol/L U46619預收縮基礎上，0.1%、0.3%、1%的乙醇對大腦中動脈環的收縮幅度分別為(12.30±8.73)%、(32.16±16.76)%、(80.19±20.15)%，預孵硝苯地平0.3 μmol/L時，可以抑制0.1%、0.3%、1%的乙醇對大腦中動脈的收縮作用(P<0.05)，其收縮百分比分別為(2.30±1.29)%、(11.52±8.26)%、(55.42±21.98)%。詳見圖7。

注：與對照組比較，★P<0.05。

圖7硝苯地平對U46619預收縮基礎上乙醇所致的大腦中動脈環收縮作用的影響

3　討　論

本實驗觀察不同濃度乙醇在不同預收縮劑基礎上對不同組織來源微動脈的收縮作用，結果表明：在預收縮劑基礎上，大鼠冠狀動脈、腎動脈、大腦中動脈環的張力隨著乙醇濃度的增高而增高，并具有組織差異性，且該收縮可能與絲裂原活化蛋白激酶、Rho激酶和鈣通道有關。

U46619作為血栓素A2受體激動劑，可以引起大鼠不同臟器微動脈環收縮，前期研究證明：U46619引起的微動脈收縮與一氧化氮(NO)和前列環素有關[8]，乙醇可以加強U46619 引起的微動脈的收縮作用，也可能與NO和前列環素有關，而NO和前列環素是血管內皮細胞生成和釋放的主要舒張血管物質。在體外培養內皮細胞發現，乙醇可以降低其生存率，增加凋亡比例，破壞內皮細胞的正常形態[9]，國外已有報道，通過長期乙醇的攝入，可以破壞NO介導的腦小動脈的舒張作用[10]，因此進一步的血管環實驗探討在預收縮基礎上乙醇引起的微動脈的收縮是否與NO和前列環素有關。在血管平滑肌細胞上存在多種類型的離子通道，其中鉀通道分布最廣泛，本實驗觀察到在KCl預收縮基礎上乙醇可以引起微動脈收縮，說明乙醇可以加強KCl引起的膜去極化的作用，這可能與乙醇阻斷血管平滑肌細胞上某些K+通道的作用有關。內皮素是血管內皮生成的縮血管物質，在心血管動態平衡中起關鍵作用，其縮血管效應與鈣通道的開放和磷脂酶活化有關[11]，乙醇對ET引起的微動脈收縮具有協同作用，該協同作用可能與激活某些鈣通道有關。有研究發現：乙醇可以引起胸主動脈的收縮，而這種收縮作用是通過增加細胞內鈣離子來實現的，與氧化還原反應和環氧酶依賴途徑有關[12]。本實驗在預孵鈣通道阻斷劑硝苯地平時，可以抑制乙醇所致的大腦中動脈的收縮作用，更加證實了這一觀點。

血管平滑肌細胞在調節血管舒縮方面起到很重要的作用，而乙醇可以通過抑制MAPK來防止大鼠胸主動脈平滑肌細胞的增殖分裂[13-14]，MAPK在調節平滑肌細胞的生長過程中扮演關鍵的角色。本實驗中選用MAPK家族中p38MAPK、ERK的抑制劑SB239063、PD98059，觀察到SB239063可以抑制0.1%的乙醇引起的冠狀動脈收縮，PD98059可以抑制0.1%、0.3%的乙醇引起的冠狀動脈的收縮；Rho激酶在MAPK系統的上游，自身活化可以激活MAPK，Rho相關激酶ROCK的抑制劑之一Y27632可以抑制0.1%、1%的乙醇對冠狀動脈環的收縮作用。由此可以推斷乙醇引起的冠狀動脈環的收縮作用可能與MAPK家族、Rho相關激酶有關。

乙醇在心腦血管系統中的作用機制比較復雜，本實驗只是在血管環水平簡單觀察乙醇對微動脈的收縮作用及其與激酶抑制劑的作用，其具體的收縮機制還需要在細胞水平和分子水平上做進一步的證明。近年來，全球飲酒人數越來越多，乙醇對人類健康的危害也受到重視，探討乙醇的作用機制變得愈發重要。

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(本文編輯郭懷印)

山西醫科大學(太原 030001)

張明升，E-mail：18335170902@139.com

R329R256.2

Adoi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．14．013

1672-1349(2016)14-1606-05

2015-10-25)