大鼠腦出血模型中血腦屏障開放規律及應用腦血疏口服液治療腦水腫的實驗研究

張亞紅，劉重霄，周　任，師　蔚，郭振宇

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大鼠腦出血模型中血腦屏障開放規律及應用腦血疏口服液治療腦水腫的實驗研究

張亞紅，劉重霄，周任，師蔚，郭振宇

目的在建立大鼠腦出血(ICH)模型基礎上，通過觀察血腦屏障(BBB)開放規律及早期應用藥物進行干預，探討ICH后腦損傷的致病機制及治療方案。方法選用SD大鼠78只，隨機分為ICH組、治療組和對照組，各組又隨機分為1 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d亞組，ICH組、治療組注射Ⅳ型膠原酶建立ICH模型，造模后進行腦含水量及伊文氏蘭含量測定。結果ICH組：腦出血后早期(1 h)即有腦水腫出現，6 h至3 d腦水腫增加明顯，7 d后漸下降；治療組：腦水腫于3 d左右開始明顯增加，7 d后下降。腦出血后BBB變化：1 h腦出血組和治療組即有伊文氏蘭滲出，ICH組分別造模后6 h和3 d達到高峰；治療組于造模后6 h到達高峰。結論腦血疏口服液可以通過抑制BBB的開放，減輕腦水腫的發生、發展，從而減輕ICH后腦損傷。

腦出血；腦水腫；腦血疏口服液；血腦屏障；中風

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后腦內血腫及其分解產物可引起腦組織繼發損傷，并產生一系列病理生理改變。研究表明：腦出血早期即有血腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞并伴有血管源性腦水腫等繼發性腦損傷發生，而且隨著BBB的破壞及通透性增加，血液成分及其降解產物和炎性細胞大量滲入腦組織中，導致神經元凋亡和腦組織進一步損傷[1]。那么ICH后BBB破壞具體時程如何，目前研究結果仍未有定論，故如何早期對BBB進行干預，是國內外神經科學領域關心的熱點。近年的研究表明：腦血疏口服液具有益氣、活血、化瘀之功效，臨床應用發現其確實對ICH病人顱內血腫吸收起到促進作用[2]，但其確切治療機制仍未完全明了。本實驗擬在建立大鼠ICH模型基礎上，觀察BBB開放規律及早期應用腦血疏口服液進行干預的效果，ICH后腦損傷的致病機制及治療方案。

1　材料與方法

1.1動物分組健康清潔SD大鼠78只，體重250 g～300 g，雄性，由西安交通大學動物實驗中心提供。實驗動物使用隨機數字表法分為ICH組、治療組和對照組。ICH組和治療組再隨機分為1 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d亞組，每亞組6只大鼠，對照組共6只大鼠，各組間動物體重差異無統計學意義。

1.2ICH動物模型建立用Ⅳ型膠原酶建立ICH模型，大鼠術前12 h禁飲食4 h禁水，0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)，必要時水合氯醛補充麻醉，保證手術操作期間大鼠有自主呼吸，俯臥位固定于動物頭顱立體定向儀上，頭皮“釘子型”剪開，取前囟為原點，向右3 mm，向后1 mm，深度5 mm為注射點(尾狀核)，磨鉆磨開顱骨，進針后緩慢注射Ⅳ型膠原酶、肝素和生理鹽水混合溶液(每1 μL含Ⅳ型膠原酶0.2 U及肝素2 U)，留針10 min，緩慢退針，骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。術中注意大鼠呼吸情況并保持呼吸道通暢，大鼠體溫控制在36.5 ℃～37.5 ℃，術畢動物送入有空調的動物房飼養。對照組按Ⅳ型膠原酶法注入相同劑量生理鹽水；治療組按上述造模方法每8 h灌服腦血疏口服液1 mL/kg，ICH組及對照組灌服生理鹽水。

1.3腦組織含水量測定(干濕重法)術后在相應時間點用過量的水合氯醛麻醉動物，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳剪開一小口當作出口。4%多聚甲醛100 mL快速灌注，之后稍減慢灌注速度繼續固定，灌注約30 min至動物四肢變硬，斷頭取腦，測濕重標本，取ICH側皮質針孔前組織，厚約3 mm腦組織測定濕重，然后將標本放于95 ℃烘箱中烘干24 h再稱重，干濕重均由電子分析天平稱量。腦組織含水量按如下公式計算：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%，干濕重均精確到0.1 mg。

1.4伊文氏蘭注射及標本采集對照組注射2%伊文氏蘭3 mL/kg后24 h處死，ICH組和治療組于造模前1 h注射等量的伊文氏蘭。取腦前，用生理鹽水左心室灌注至右心耳流出清亮液體。橫斷面切取損傷平面厚約3 mm的腦組織，將其分為ICH側皮質、皮質下和健側皮質、皮質下4個部分，分析天平上稱取其濕重，將各部分放入勻漿器勻漿，勻漿液為2 mL的50%三氯乙酸(TCA)，充分勻漿后，將組織勻漿液15 000 r/min離心20 min，在伊文氏蘭最大吸收光譜635 nm處檢測吸光度，從伊文氏繪制標準曲線上查得伊文氏蘭含量結果。

2　結　果

2.1ICH后大鼠腦組織含水量變化規律ICH組在造模后1 h即有腦組織含水量增加，但此時與治療組和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；6 h時ICH組腦含水量較治療組和對照組增加明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，但治療組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；3 d時ICH組含水量達到高峰，與治療組和對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，并且此時治療組和對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；7 d時ICH組腦含水量仍高于對照組和治療組(P<0.05)，但治療組和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；14 d時ICH組與治療組和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1　ICH后腦組織水腫量變化(±s)　 %

2.2ICH后大鼠腦組織伊文氏蘭變化規律ICH后1 h腦出血組和治療組即有伊文氏蘭滲出，ICH組分別造模后6 h和3 d達到高峰；治療組于造模后6 h達高峰。詳見表2。

表2　ICH后大鼠腦組織伊文氏蘭變化(±s)　 μg/g

3　討　論

腦出血是嚴重危害人類健康的常見病和多發病，ICH后繼發性腦損傷是導致ICH病人致殘率和死亡率極高的重要原因之一。目前關于ICH后腦損傷的研究認為損傷原因包括兩方面：一是原發性腦損傷或稱直接腦損傷，其損傷機制為ICH后神經元胞體受到擠壓，軸突遭受撕扯、斷裂及ICH后神經細胞在營養攝取方面障礙，從而導致相應的腦損傷；二是繼發性腦損傷或稱間接腦損傷，其損傷機制包括血腫腔及周圍急性炎性反應、血細胞的滲出及局部或全身免疫細胞的激活，并釋放大量的有害因子(如免疫因子、血紅蛋白)造成的腦損傷，同時有血腦屏障的破壞及腦水腫、腦腫脹的形成，最終引起腦疝致病人死亡[3]。有關繼發性腦損傷的研究證實：ICH后紅細胞成分血紅蛋白被釋放到腦組織或蛛網膜下腔中，其在代謝過程中產生脂質過氧化反應導致了神經元細胞膜損傷、DNA片斷化和細胞凋亡[4-6]。目前研究認為繼發性腦損傷在ICH后腦損傷中占有主導地位，而BBB的破壞又是繼發性腦損傷的中心環節[7]。

現階段對BBB開放規律及時間還尚未定論：Hartl等[8]在研究動物腦皮質損傷(cortical contusion injury，CCI)后認為，BBB開放存在兩個高峰，BBB于腦損傷后1 h左右首次開放，于24 h達到第1次高峰，其后漸下降。第2次開放高峰形成于傷后第3天；Baskaya等[9]在研究腦外傷(traumatic brain injury，TBI)后提出：腦損傷后BBB兩次開放高峰分別形成于4 h～6 h和72 h，并且兩次BBB開放與外傷后原發和繼發性腦損傷是相對應的，認為腦外傷可以直接導致BBB 破壞即第1次開放高峰的到來，而第2次BBB開放高峰不僅使血細胞外滲，而且還有很多炎性因子也隨之滲出，這是炎性因子再次破壞BBB內皮細胞的前提，也為第2次BBB 開放作了準備。本次實驗通過觀察大鼠ICH后腦組織含水量及檢測鼠腦組織中伊文氏蘭含量得出了與TBI后BBB開放規律類似的結論：ICH后早期(1 h～6 h)即有BBB開放并有腦水腫發生，至ICH后3 d左右BBB再次開放，同時到達水腫最高峰，7 d后水腫緩慢下降，14 d后基本恢復對照組水平。

腦血疏口服液具有益氣、活血、化瘀的作用，其主要成分為黃芪、水蛭、 石菖蒲、牛膝及川芎，主要用于氣虛血瘀所致中風病人。近年來，腦血疏口服液廣泛應用于出血性腦血管病的治療，療效肯定[10]。謝道珍等[2]研究結果顯示：將腦血疏口服液用于出血腦中風病人后，其治療組總有效率高達87.74%。本次實驗中，治療組應用腦血疏口服液進行干預后，BBB開放起始時間較ICH組延后，并且腦水腫程度明顯降低。現在對BBB相關研究較多集中在其破壞方式上，主要有兩種：其一是毛細血管內皮細胞損傷即細胞的壞死或凋亡；其二是細胞間緊密聯結的破壞[11]。那么腦血疏口服液是通過何種渠道對BBB進行保護，這還需進一步研究證實。

綜上所述，腦血疏口服液可以減輕ICH后腦損傷的可能機制：通過抑制BBB的開放，減輕腦水腫的發生、發展，從而達到改善神經功能的目的。

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(本文編輯郭懷印)

西安交通大學第二附屬醫院(西安 710004)

郭振宇，E-mail：guozhenyu1818@sina.com

R741R289.5

Adoi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．14．015

1672-1349(2016)14-1613-03

2016-01-09)