穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞系的建立

李　琪，李華濤，叢　霞，姜忠玲，曹榮峰，田文儒

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞系的建立

李琪，李華濤，叢霞，姜忠玲，曹榮峰，田文儒

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

為了建立穩(wěn)定表達HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞系，本試驗應(yīng)用PCR法擴增HSP72基因，插入真核表達質(zhì)粒EGFP-N2中構(gòu)建EGFP-N2-HSP72重組質(zhì)粒。以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)染于奶牛乳腺上皮細胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞，并且轉(zhuǎn)染的HSP72基因序列正確。陰性對照組EGFP-N2的奶牛乳腺上皮細胞在熒光顯微鏡下呈綠色熒光，且重組質(zhì)粒組極顯著（P<0.01）表達HSP72蛋白。表明成功構(gòu)建了EGFP-N2-HSP72真核表達載體，并建立了高表達HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞系。

HSP72；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；真核表達；奶牛乳腺上皮細胞

奶牛乳腺炎是奶牛乳腺受到微生物及理化因素刺激所發(fā)生的炎性變化，是奶牛多發(fā)性疾病，給奶牛業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失，危害奶業(yè)發(fā)展。大量人類醫(yī)學(xué)報道熱休克蛋白（HSP）70表達增加有明顯的抗炎癥作用[1]。我們實驗室前期研究表明，LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)中，HSP72呈現(xiàn)高表達。誘導(dǎo)型HSP72在大鼠肝臟熱缺血再灌注中抑制肝臟NF-肝臟活性，減輕肝臟炎癥反應(yīng)[2]。如上，HSP72能抑制NF-72活性，通過細胞內(nèi)NF-通過調(diào)節(jié)機制來參與應(yīng)激保護作用，減輕細胞的損傷。因此研究HSP72高表達對炎癥反應(yīng)具有重要的意義。本試驗旨在建立穩(wěn)定表達HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞系，為進一步研究乳腺炎中HSP72蛋白調(diào)節(jié)炎癥的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1奶牛乳腺上皮細胞系本實驗室鑒定并保存。

1.2主要試劑pMDTM18-T載體克隆試劑盒、限制性內(nèi)切酶HindⅢAccⅠ，購自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；E.coli DH5α、G418，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Lipofectami?neTM3000，購自Invitrogen公司；HSP72抗體，購自Santa cruz公司，二抗，購自Jackson ImmunoResearch公司。

1.3擴增牛HSP72基因及產(chǎn)物回收收集<107懸浮細胞于1.5 mL離心管，按組織細胞RNA快速提取試劑盒說明提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增HSP72基因。牛HSP72引物（GenBank Acc：BC103083）設(shè)計加入HindⅢ和AccⅠ酶切位點，上游引物：5′-GAGCTCAAGCTTC ATGGC?GAAAAACATGG-3′；下游引物：5′-GGTATCGTC?GACA TAATCCACCTCCTCAATG-3′。cDNA 0.1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，Ex Taq聚合酶0.4 μL，10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，50μL體系。95℃5 min，95℃1 min，60℃45 s，72℃2.5 min，30 s，72℃10 min。PCR鑒定后切取HSP72條帶，按膠回收試劑盒說明洗脫DNA。

1.4EGFP-N2-HSP72真核表達載體的構(gòu)建與鑒定將洗脫DNA連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞擴增培養(yǎng)陽性克隆，將測序驗證的陽性克隆菌液提取18-T-HSP72質(zhì)粒，HindⅢ和AccⅠ雙酶切18-T-HSP72及EGFP-N2載體37℃溫育5 h。回收HSP72片段和酶切的EGFP-N2用T4 DNA連接酶于16℃水浴連接過夜。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆菌液進行PCR鑒定。

1.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP72基因的奶牛乳腺上皮細胞系建立按質(zhì)粒大提試劑盒說明提取質(zhì)粒DNA。每孔0.25～1×106個細胞接種于6孔板中，待細胞匯合度達70%～90%，每孔加2 mL Opti-MEM培養(yǎng)基對細胞進行饑餓處理1 h，用Opti-MEM分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000和重組質(zhì)粒DNA靜置5 min，將二者混勻靜置20 min后加入6孔板，于37℃溫箱孵育6 h，去除轉(zhuǎn)染液加入含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h，在488 nm波長激發(fā)光下，熒光顯微鏡觀察EGFP-N2表達情況，再換用G418培養(yǎng)基篩選2周得到穩(wěn)定表達HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞系。

1.6奶牛乳腺上皮細胞系中HSP72蛋白表達鑒定

收集轉(zhuǎn)染EGFP-N2-HSP72組、EGFP-N2組及正常組奶牛乳腺上皮細胞，提取總蛋白，加熱變性進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，再封閉2 h，按順序加入羊抗牛HSP72（1∶1 000）、兔抗羊IgG-HRP（1∶3 000）孵育，顯色后拍照鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1PCR擴增HSP72基因結(jié)果各樣品用含酶切位點的引物均擴增出了同預(yù)期一致特異性片段，經(jīng)擴增HSP72基因片段約1 951 bp（圖1）。

圖1　HSP72基因擴增

2.2連接18-T載體后單菌落PCR鑒定、測序與酶切鑒定PCR產(chǎn)物與18-T連接，陽性菌液PCR顯示4個HSP72基因片段均約為1 951 bp，同預(yù)期結(jié)果一致（圖2），測序結(jié)果表明，HSP72序列與GenBank中奶牛HSP72基因序列相同，進一步表明擴增出了正確的HSP72基因片段。

圖2　連接18-T載體HSP72基因單菌落PCR鑒定

限制性內(nèi)切酶HindⅢ和AccⅠ雙酶切pMD 18-T-HSP72質(zhì)粒，出現(xiàn)預(yù)期大小的兩條條帶，HSP72為1 925 bp，pMD 18-T為2 692 bp（圖3），說明18-T載體構(gòu)建正確。

圖3　pMD 18-T-HSP72質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3真核表達載體EGFP-N2-HSP72菌液PCR鑒定與測序EGFP-N2-HSP72菌液進行PCR鑒定，出現(xiàn)的片段約為1 925 bp，同預(yù)期結(jié)果一致（圖4），測序結(jié)果表明，HSP72序列與GenBank中奶牛HSP72基因序列相同，表明載體構(gòu)建正確。

2.4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的篩選將測序正確的載體單克隆搖菌，提取EGFP-N2-HSP72質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于奶牛乳腺上皮細胞G418后，倒置熒光顯微鏡下觀察陰性對照EGFP-N2呈綠色熒光（圖5）。

圖4　真核表達載體EGFP-N2-HSP72陽性單菌落鑒定

圖5　轉(zhuǎn)染空載體EGFP-N2的奶牛乳腺上皮細胞

2.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后奶牛乳腺上皮細胞中HSP72蛋白的檢測各組細胞均有HSP72和內(nèi)參蛋白兩條條帶（圖6）。與正常細胞組和空載體EGFP-N2組比，EGFP-N2-HSP72組HSP72蛋白的表達量極顯著（P<0.01）增加（圖7）。

圖6　各組細胞HSP72蛋白SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果

圖7　免疫印跡檢測奶牛乳腺上皮細胞HSP72蛋白表達

3　討論與結(jié)論

熱休克蛋白（HSPs）是細胞受到應(yīng)激后產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，HSP70是HSPs家族中最主要的，被認為是整個進化中最保守的蛋白之一[2]。HSP72（誘導(dǎo)型HSP70）由于在正常細胞很少甚至不表達，而應(yīng)激時卻明顯增加，因此，HSP72是目前國內(nèi)外該研究中最深入的一種[3]。

HSP72的表達與多種炎性疾病有關(guān)，能夠抑制致炎因子和誘導(dǎo)抗炎因子，以減輕對組織細胞的炎癥反應(yīng)。重組HSP72能誘導(dǎo)抗炎細胞因子IL-10生成，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)[4]。細胞外HSP72通過下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞IL-6、IL-8產(chǎn)生和分泌及抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用[5]。

本研究采用G418作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中的抗性篩選試劑[6]，轉(zhuǎn)染載體攜帶HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞可在含G418的培養(yǎng)基中存活[7]。由于正常組未轉(zhuǎn)染任何載體，在G418篩選時細胞大部分被殺死，所以陰性對照組HSP72蛋白顯著升高[8]。倒置熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染空載體EGFP-N2的細胞可見綠色熒光標記，表明成功將HSP72基因轉(zhuǎn)染于奶牛乳腺上皮細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-N2-HSP72組HSP72蛋白表達量極顯著升高，表明HSP72蛋白高表達。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了真核表達載體EGFP-N2-HSP72并建立了穩(wěn)定表達HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮細胞系，為進一步研究牛乳腺炎中HSP72蛋白調(diào)節(jié)炎癥的分子機制奠定基礎(chǔ)。

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Establishment of BovineMammary Epithelial Cell Linewith StableTransfection and High Expression HSP72 Protein

LI Qi，LI Hua-tao，CONG Xia，JIANG Zhong-ling，CAO Rong-feng，TIAN Wen-ru
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

In order to establish a stable bovine Mammary Epithelial Cell（bMEC）line expressing HSP72 protein，HSP72 gene was amplified by PCR and inserted into the eukaryotic expression plasmid EGFP-N2to construct the recombinant plasmid EGFPN2-HSP72.Liposome-mediated method was used to transfect it into bMEC.After selecting by G418，the stable bMEC line expres?sion HSP72 protein was obtained.Negative control plasmid EGFP-N2 of bMEC showed green fluorescence under a fluorescence mi?croscope，and the recombinant plasmid had a very significant high expression of HSP72 protein.Here，we successfully constructed an EGFP-N2-Hsp72 eukaryotic expression vector，and established a bMEC line with high expression of HSP72 protein.

HSP72；Stable transfection；Eukaryotic expresson；Cow mammary epithelial cells

TIAN Wen-ru

S823

A

0529-6005（2016）07-0003-03

2015-05-25

國家自然科學(xué)基金（31172378，31572590）；山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊（SDAIT-12-011-03）

李琪（1988-），女，碩士，主要從事基因蛋白檢測研究，E-mail：liqi991@qq.com

田文儒，E-mail：wrtian@126.com