咪達唑侖對山羊不同腦區Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

鄭　宇，李　德，潘佳亮，高　利

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

咪達唑侖對山羊不同腦區Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

鄭宇，李德，潘佳亮，高利

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

為研究咪達唑侖對山羊不同腦區Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響，探討其在中樞麻醉的作用機制。試驗用15只健康山羊，3只為生理鹽水對照組，其余為試驗組，試驗組山羊肌肉注射14 mg/kg體重咪達唑侖。分別在給藥后誘導期、麻醉期、恢復Ⅰ期和恢復Ⅱ期4個時間點，每點剖殺3只山羊取腦組織，采用分光光度法測定不同腦區Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。結果注射咪達唑侖能明顯抑制山羊大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，這種變化趨勢與山羊肌肉注射咪達唑侖麻醉后行為學變化基本一致，海馬的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在整個麻醉過程中無明顯變化。表明咪達唑侖的麻醉作用可能與抑制山羊大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性相關。

Ca2+-Mg2+-ATP酶；山羊；咪達唑侖

Ca2+-Mg2+-ATP酶（又稱鈣泵），是細胞膜上一種重要的酶，在維持細胞內Ca2+和Mg2+濃度穩定，神經細胞動作電位的傳導、心肌及其他肌肉的收縮、細胞的分泌和繁殖方面均有重要影響[1-2]。咪達唑侖（Midazolam、Dormicum）是苯二氮卓類麻醉劑，具有抗焦慮、鎮靜、安眠、肌肉松弛、抗驚厥作用[3]。曾經有過關于復合麻醉劑對豬Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響的相關報道，也有關于咪達唑侖對山羊中樞麻醉機制的研究，但到目前為止，咪達唑侖麻醉山羊時對山羊不同腦區的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響還沒有報道。本實驗針對咪達唑侖麻醉對山羊各個腦區進行研究，以了解咪達唑侖麻醉山羊時各腦區Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的情況，探討咪達唑侖對山羊麻醉的中樞機制及其在中樞神經系統的相關作用位點。

1　材料與方法

1.1試驗動物8月齡健康山羊15只（購自哈爾濱郊區養殖戶，醫學檢查健康），體重13～15 kg，雌雄兼用（雌性7只，雄性8只），試驗前在動物舍喂養1周以適應環境。試驗前12 h禁食禁水。

1.2儀器和藥品AvantiTM30Centrifuge高速冷凍離心機，購自Japanese Beckman Company；BioTek EpochTM多體積分光光度計，購自美國伯騰儀器有限公司；咪達唑侖注射液，由哈爾濱醫科大學提供；ATP酶測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白含量測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3動物分組及樣品采取15只山羊隨機分為兩組：對照組（生理鹽水組）3只、試驗組12只，其中試驗組按照給藥后測定時間分為麻醉誘導組（注藥后5 min）、麻醉組（翻正反射消失）、恢復Ⅰ組（翻正反射恢復時）、恢復Ⅱ組（翻正反射恢復后6 h）4個時間點每個時間點3只。對照組與麻醉組分別肌肉注射生理鹽水1.5 mL/kg體重，咪達唑侖14 mg/kg體重，于各時間點處死山羊開顱，取腦組織，用4℃生理鹽水沖凈腦組織附著的血液，置于冰面上迅速分取雙側大腦皮層、小腦、丘腦、腦干和海馬。稱重后按1∶9（W/V）置入預冷的生理鹽水溶液中勻漿，然后3000 r/min（-4℃）高速離心10 min，取上清液。行為學變化分組標準按照師銘咸等[5]所述標準判定。

1.4檢測方法采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，比色法測定ATP酶催化分解ATP生成的無機磷。

2　試驗數據的分析與統計

本試驗Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影響的檢測結果應用SPSS 13.0 for Windows數據統計分析軟件，對數據進行一維方差分析，對照組與試驗組變量間簡單相關分析采用直線相關回歸分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。應用Micro?soft Excel 2007對試驗數據進行作圖。

3　試驗結果與分析

3.1咪達唑侖麻醉下山羊行為學變化試驗組山羊注藥后表現逐漸安靜，行動遲緩，共濟失調，趴臥不動，最后翻正反射消失。翻正反射平均消失時間為8.46±2.67 min。在麻醉期間，山羊眼半閉，眼球向內下方翻轉，對光反射存在。眼瞼反射、角膜反射明顯減弱，肛門反射存在，較少出現流涎。翻正反射恢復的平均時間為45.68±4.52 min；而對照組無明顯行為學變化。

3.2咪達唑侖麻醉對山羊腦組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影響的檢測結果見表1。

表1　咪達唑侖麻醉對山羊不同腦區Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響　（n=3，±SD）

表1　咪達唑侖麻醉對山羊不同腦區Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響　（n=3，±SD）

**：與對照組比較P<0.01，差異極顯著；*：與對照組比較P<0.05，差異顯著；▲▲：與麻醉期比較P<0.01，差異極顯著；▲：與對照組比較P<0.05，差異顯著

大腦　海馬　丘腦　小腦　腦干對照組　5.37±0.36　4.17±0.16　5.18±0.52　3.87±0.69　4.14±0.50誘導期　4.57±0.76　4.05±0.44　4.29±0.65*　2.78±0.84*　3.46±0.45▲▲麻醉期　3.94±0.53*　3.49±0.34　3.56±0.32**　2.15±0.14**　2.16±0.27**恢復Ⅰ期　4.21±0.37*　3.67±0.75　4.77±0.22▲▲　3.27±0.34▲　3.04±0.18*▲恢復Ⅱ期　4.67±0.62　4.09±0.42　5.16±0.38▲▲　3.50±0.35▲　3.92±0.63▲▲

如表1所示，在咪達唑侖麻醉過程中，山羊海馬區域的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性無明顯變化。大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯受到抑制。在誘導期，大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與對照組比較，分別降低14.9%（P> 0.05）、17.2%（P<0.05）、28.2%（P<0.05）和16.4%（P> 0.05），差異不顯著或顯著。麻醉期大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均受到明顯抑制，與對照組比較，分別降低26.6%（P<0.05）、31.3%（P< 0.01）、44.4%（P<0.01）和47.8%（P<0.01），差異顯著或極顯著。恢復I期丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明顯恢復，與麻醉期比較，分別升高34.0%（P<0.01）、52.1%（P<0.05）和40.7%（P<0.05），差異顯著或極顯著，大腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性仍受到明顯抑制，與對照組比較差異顯著（P< 0.05），恢復II期上述腦區的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性基本恢復到對照組水平，大腦的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與麻醉期比較差異不顯著（P>0.05），小腦的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與麻醉期比較差異顯著（P<0.05），丘腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與麻醉期比較差異極顯著（P<0.01）。大腦、丘腦、小腦和腦干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性變化趨勢與山羊行為學變化相平行（基本吻合），海馬的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性變化趨勢與山羊行為學變化相比較，沒有規律。

4　討論

Ca2+-Mg2+-ATP酶，也稱Ca2+泵或Ca2+-ATP酶。中樞神經系統對Ca2+濃度的調節除通過各型Ca2+通道外，主要是通過Ca2+-ATP酶和Na+/Ca2+這兩個機理維持細胞內Ca2+穩態[2]。Ca2+在神經傳導、肌肉收縮、細胞分泌和增殖、形態發生、細胞老化等許多細胞反應過程中都有調節作用。腦細胞膜上存在的Ca2+-Mg2+-ATP酶能不斷將進入細胞內的Ca2+逆電化學梯度泵出至細胞外，使細胞內Ca2+濃度保持穩定狀態，維持正常的細胞功能[5]。細胞的多種功能都依賴于細胞內外極高的Ca2+濃度差存在（胞外Ca2+濃度大約比胞內高出10 000倍），一旦這種濃度差減低，細胞就會受到功能性損傷，甚至引起死亡。Ca2+-Mg2+-ATP酶能夠直接利用ATP為能源，逆濃度梯度主動的把細胞內液的Ca2+泵出膜外，以維持胞內Ca2+的低穩態，從而保證神經細胞的正常興奮性[6]。有研究表明，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低必然影響胞漿和胞內Ca2+穩態，導致胞內Ca2+的蓄積[Ca2+]i升高，從而影響神經細胞動作電位的產生與興奮性傳導，產生一定的中樞抑制效應[7]。

本試驗結果表明，肌肉注射咪達唑侖后，隨著翻正反射的消失，山羊大腦、丘腦、小腦和腦干內Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均受到明顯抑制，待翻正反射恢復并能自由走動后，上述腦區內Ca2+-Mg2+-ATP酶活性基本恢復到正常水平，這種變化趨勢與山羊的行為學變化相平行。而在麻醉過程中，山羊海馬內Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，未發生明顯變化。分析試驗結果推斷，大腦、丘腦、小腦和腦干內Ca2+-Mg2+-ATP酶可能是咪達唑侖全麻作用的靶位之一，且咪達唑侖全麻作用可能與抑制這些腦區內Ca2+-Mg2+-ATP酶活性相關。

Buljbasic N等研究發現，咪達唑侖對犬心肌細胞K+通道中的ICa產生一個劑量依賴性抑制[8]。這一研究表明，咪達唑侖可以抑制胞內游離Ca2+泵出胞外，這可能是由于Ca2+，Mg2+-ATP酶活性受到抑制的結果，與本試驗的結果一致。

5　結論

本試驗結果表明，咪達唑侖可抑制山羊大腦、丘腦、小腦和腦干內Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。山羊上述腦區的Ca2+-Mg2+-ATP酶可能是咪達唑侖全麻作用的靶位之一。

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Effect of midazolam on Ca2+-Mg2+-ATP enzymeactivity in different encephalic regions of goats

ZHENG Yu，LI De，PAN Jia-liang，GAO Li
（College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the effect of midazolam on Ca2+-Mg2+-ATP enzyme activity in different brain regions of goats and to ex?plore its central mechanism，we used 15 healthy goats with three of them as saline control group and the rest as experimental group.The goats in experimental group were intramuscular injected with 14 mg/kg midazolam.Goats in experimental group were ex?ecuted in induction period，anesthesia period，recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II after in?duction，respectively，and there brain tissues were taken immediately.Spectrophotometric method was used to determine the activi?ty of Ca2+-Mg2+-ATP in different brain regions of goats.midazolam significantly inhibited Ca2+-Mg2+-ATP activity in goats’cere?brum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem，but there were no significant changes of Ca2+-Mg2+-ATP activity in the hip?pocampus.The results indicate that the narcotic effect of midazolam may be related to the inhibition of Ca2+-Mg2+-ATP activity in goats’cerebrum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem.

midazolam；Ca2+-Mg2+-ATP enzyme；goat.

GAO Li

S858.27

A

0529-6005（2016）07-0016-03

2015-06-18

國家自然科學基金（31372491）；黑龍江省自然科學基金面上項目（C2011B）；黑龍江省教育廳面上項目（12531016）

鄭宇（1990-），女，碩士，研究方向為臨床獸醫學，E-mail：1226733062@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com