重慶某鱷魚館病死暹羅鱷大腸桿菌分離鑒定及藥敏試驗

趙　川，黃光遠，張夢思，李和賢，周作勇，黃慶洲

（西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌 402460）

重慶某鱷魚館病死暹羅鱷大腸桿菌分離鑒定及藥敏試驗

趙川，黃光遠，張夢思，李和賢，周作勇，黃慶洲

（西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌 402460）

2015年4月至5月間，重慶某鱷魚館3只9歲齡暹羅鱷發病，4月21日死亡1只。發病情況：3只暹羅鱷從2014年秋季開始發生局部皮膚皸裂，并從裂口處流出黃水，4、5 d后形成淡白色潰瘍，發病期間食欲不振，不愿移動，用氨芐西林膠囊、甲硝唑粉皮膚裂口處外用，同時頭孢曲松鈉肌肉注射，幾天后稍有好轉，但不能痊愈。2015年開春后，發病更為嚴重，經常發生皮膚皸裂潰爛，4 月18日1只發病鱷不食，臥地不動，排少量黃色惡臭稀便，4月21日死亡。剖檢可見肺高度腐敗、惡臭，心表面有大量豆腐渣樣沉積物，腸壁充血、水腫，肝腫脹，表面有少量纖維素性透出物。其他兩只發病鱷臨床癥狀相似。根據內臟剖檢特征，疑似大腸桿菌感染，并從病死鱷肺、肝、心組織中均分離到大腸桿菌，敏感試驗表明，分離菌對阿米卡星敏感，建議鱷魚館立刻使用該藥，用藥5 d后，情況開始好轉，2周后基本痊愈。現將該鱷魚館大腸桿菌的分離鑒定、藥敏試驗及治療情況報告如下。

1　材料與方法

1.1材料主要儀器：BA2303光學顯微鏡、恒溫培養箱、無菌操作臺、PCR儀、DYY-8C電泳儀、凝膠成像分析系統。

主要藥品：普通瓊脂培養基、S.S.培養基、麥康凱培養基、LB營養肉湯；細菌基因組DNA提取試驗盒（廣州飛揚生物工程有限公司，批號：2661445）；PCR試劑盒（TaKaRa公司）；藥敏紙片（批號：121012，杭州天和微生物試劑有限公司）。

試驗動物：昆明種普通級小鼠20只（由西南大學榮昌校區實驗動物科提供）。

1.2方法

1.2.1目標菌分離取病死鱷魚肝、肺組織及心血分別接種于LB營養肉湯，置37℃、增菌培養24 h，將培養物劃線接種于普通營養瓊脂平板，獲得單個菌落后進行鑒定。

1.2.2分離菌鑒定將目標菌劃線接種于麥康凱培養基、S.S.營養瓊脂培養基上，37℃，恒溫培養24 h，觀察菌落特征，同時將純培養疑似菌革蘭染色鏡檢。

將分離菌接種到硫化氫、葡萄糖、木膠糖等微量糖發酵管內，同時進行吲哚、M.R.、V-P試驗，37℃恒溫培養24 h后，觀察產酸、產氣情況。

1.2.3分離菌16S rRNA基因PCR擴增及序列測定

參照劉洋等[1]方法進行。提取分離菌DNA，以16S rRNA通用引物進行PCR擴增，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，比較擴增目的基因片段大小，并將PCR產物送英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，登入NCBI將測得的序列在BLAST中檢索細菌同源性。

1.2.4小鼠致死性試驗將純培養菌株接種營養肉湯，37℃培養24 h，用滅菌生理鹽水稀釋成1～2×108個菌懸液備用；每株分離菌腹腔接種5只健康小鼠0.2 mL/只，同時設5只健康小鼠注射等量無菌營養肉湯液作為對照。觀察并記錄小鼠在接種后72 h內的死亡情況。

1.2.5藥敏試驗采用紙片擴散法[2]進行。

1.2.6治療方案根據藥敏試驗結果，選擇敏感抗生素對其他兩只發病鱷魚進行治療，考慮發病及不食時間較長，建議肌肉注射肌苷、輔酶A、ATP能量合劑適量，每天1次，連用7 d，根據用藥后鱷魚活動、精神、叫聲、食欲情況判定治療效果。

2　結果

2.1分離菌株的培養及形態特征鱷魚肝、肺及心組織分別接種于LB營養肉湯培養24 h后均渾濁，分別接種在營養瓊脂培養基上生長菌落形態相似，直經1～2.5 mm灰色半透明、表面光滑、濕潤、邊緣整齊的圓形菌落；在S.S.與麥康凱瓊脂均長出紅色、隆起、光滑、直徑1～3 mm的桃紅色菌落；革蘭染色鏡檢為紅色、兩端鈍圓的單個或成對排列的革蘭陰性短桿菌。

2.2分離菌生化試驗從肺、心血、肝組織中分離到的3株菌生化試驗結果基本一致，除心血株產酸產氣不同外，其他生化項目均相同。結果見表1。

表1　分離菌株的生化試驗

2.3分離菌16S rRNA擴增、測序及分析選心血分離到的菌株進行16S rRNA擴增，得到單一、大小在1 500 bp左右、與目標基因片段大小相符的條帶，而且無明顯非特異性擴增條帶，結果見圖1。測序結果序列長度為1 500 bp，經Blast在線比對分析，分離菌16S rRNA序列與GenBank已收錄的大腸桿菌（ATCC Escherichia coli ACN001，登錄號為 gb?CP007442.1）相應的基因序列同源性高達99%。

1：DL Marker plus；2～3：分離菌擴增條帶

2.4致病性試驗從心血、肺、肝組織分離到的3株菌，分別接種小鼠后48 h內均全部死亡，死亡率100%，從死亡小鼠肝臟中分離獲得與接種菌一致的短桿菌，而對照組小鼠72 h內全部健康存活。

2.5藥敏試驗分離菌對阿米卡星、卡那霉素、大觀霉素、鏈霉素、氟苯尼考敏感；而對臨床常用的沙星類及頭孢類藥物耐藥。結果見表2。

表2　分離菌藥敏試驗結果

2.6治療效果根據藥敏試驗結果，建議鱷魚館獸醫將發病鱷魚隔離飼養，選用阿米卡星，按體重5萬單位/kg，肌肉注射，每天1次，給正在發病的其他兩只鱷魚連續用藥7 d，同時因發病鱷魚進食極少，精神不振，使用肌苷200 mg、輔酶A10 mg、三磷酸腺苷（ATP）40 mg能量合劑混合，肌肉注射，每天1次，連續用藥7 d；結果用藥5 d后，發病鱷精神狀態好轉，開始恢復食欲，能進食少量活鯽魚，開始正常活動，吼叫聲音清晰洪亮，背皮顏色恢復成黑色，與健康的同類膚色基本一致，2周后與其他健康鱷魚基本相似，飼養員認為已痊愈。

3　討論

根據發病暹羅鱷臨床癥狀，分離菌形態、培養特性、生化試驗、分離菌16S rDNA序列的同源性比對結果，以及致病性特點，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》[3]，可以判定從該病死鱷肝、心血、肺組織中分離的細菌為毒力很強的致病性大腸桿菌。藥敏試驗表明，分離大腸桿菌對臨床上習慣選用的頭孢類及沙星類抗生素已產生耐藥，這可能是該鱷魚館長期使用頭孢類藥物治療效果不佳的原因所在，而選用敏感的阿米卡星進行治療，很快收到了理想的治療效果，說明臨床在治療鱷魚大腸桿菌病時，必須根據藥敏試驗結果進行合理選擇，以減少耐藥菌株的形成，亦不延誤治療。

鱷魚大腸桿菌病報道較少，本文初次從西南地區人工養殖的發病暹羅鱷內臟組織中分離到該致病菌的存在，其生化特征、藥物敏感性與其他地區鱷魚大腸桿菌病報道[4]存在一定差異，其血清型、毒力強弱、流行特點等有待深入研究。大腸桿菌作為一種條件性致病菌，強化飼養管理，提高鱷魚自身的免疫抗病能力，同時做好鱷魚生活場所及水體的定期消毒，是有效控制本病的關鍵，特殊是西南地區的春秋季節，水中落葉較多，氣候潮濕，溝渠流水偏少，樹葉腐敗，水體污染，細菌大量繁殖，是本病的高發季節。

[1]劉洋，王玉田，楊龍峰，等.北京某鴨場鴨疫里默氏菌與大腸桿菌混合感染的診治[J].中國獸醫雜志，2014，50（1）：32-33.

[2]中華人民共和國衛生部.WS/T 125-1999紙片法抗菌藥物敏感試驗標準[S].北京：中國標準出版社，2000.

[3]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學出版社，1984：146-189，238-432.

[4]陳俊敏，楊珊，趙偉，等.一例鱷魚沙門菌與大腸桿菌混合感染的診治[J].畜牧獸醫科技，2007，（32）5：22-23.

S852.61文獻標志碼：B

0529-6005（2016）07-0103-02

205-08-26

趙川（1990-），男，碩士生，主要從事基礎獸醫學及臨床疾病防治研究，E-mail：510390483@qq.com

黃慶洲，E-mail：hqzrc@126.com