水溫、pH值和光照對斑馬魚受精卵孵化率的影響

陳楠，高雯，張磊，董羅濤，沈澤恩，魏文志，付立霞（江蘇省人畜共患病學重點實驗室，揚州大學動物科學與技術學院，江蘇　揚州　225009）

水溫、pH值和光照對斑馬魚受精卵孵化率的影響

陳楠，高雯，張磊，董羅濤，沈澤恩，魏文志，付立霞
（江蘇省人畜共患病學重點實驗室，揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009）

摘要：分別通過單因素實驗和正交實驗探究水溫、pH值和光照對斑馬魚受精卵孵化率的影響。依次進行的單因素實驗顯示，水溫28℃，pH值7.5，光照強度100 lx，光周期10L∶14D時孵化率最高。正交實驗結果表明上述因素對斑馬魚受精卵孵化率的影響為:水溫＞pH＝光照強度＞光照周期，理論最佳孵化條件為水溫28℃，pH值8.0，光照強度100l x，光周期12L∶12D。在孵化過程中，受精卵孵化時間隨著孵化溫度的提高而縮短，且在發(fā)育過程中存在不同步現象。

關鍵詞：斑馬魚；孵化率；水溫；pH值；光照

斑馬魚，又稱藍條魚、花條魚和斑馬擔尼魚，隸屬于鯉科（Cyprinidae），短擔尼魚屬（Brachydanio），是原產于南亞的一種亞熱帶小型淡水觀賞魚類。由于易飼養(yǎng)，個體小（成魚體長僅為3～5 cm），繁殖快（從受精卵到性成熟只需3個月左右），可周期產卵（產卵周期約10 d左右），而且早期胚胎完全透明，便于觀察內部結構，這使得斑馬魚成為生物學研究的最佳脊椎動物模型。隨著斑馬魚基因組測序工作的完成與發(fā)布，斑馬魚的應用領域不斷拓展，目前斑馬魚已被廣泛應用于發(fā)育生物學、遺傳學、免疫學、藥物學、毒理與環(huán)保等諸多方面的研究［1-2］。

持續(xù)穩(wěn)定的斑馬魚胚胎及苗種供應是開展相關研究的重要保障。為避免市售斑馬魚質量的良莠不齊，一些實驗室建立了斑馬魚繁育、養(yǎng)殖系統以保證研究的順利進行。孵化是斑馬魚人工繁育的重要環(huán)節(jié)，在一定程度上決定著后續(xù)工作的成敗，不過當前關于斑馬魚孵化的相關資料僅限于技術性描述，缺乏系統性的實驗設計［3-4］。鑒于此，本研究擬從水溫、pH值及光照等方面對斑馬魚受精卵的孵化率進行比較研究，探索斑馬魚受精卵孵化的最佳條件，提高其孵化效益，加速其在相關領域的應用研究。

1　材料和方法

1.1斑馬魚

實驗用斑馬魚購自南京夫子廟水族市場，日常飼養(yǎng)于室內水族箱內，水溫控制于28℃，投喂商用配合飼料，每天2次，分別為9：00及16：00，投飼量以斑馬魚在10 min內吃完為好。每1～2 d吸污一次，并更換部分養(yǎng)殖用水，定時用增氧泵進行增氧。繁殖前半月，將雌、雄親魚進行分開飼養(yǎng)，并投喂活性飼料進行營養(yǎng)強化，活性飼料包括去殼鹵蟲卵、草履蟲及室外撈取并經聚維酮碘浸泡消毒清洗后的紅蟲等。

1.2受精卵

實驗用受精卵通過斑馬魚的人工繁殖獲得。具體操作為：先將充分曝氣的自來水注入經消毒的水族缸中，然后放入小型繁殖網箱（44 cm×24 cm×30 cm），網箱網孔直徑約2 mm，通過側邊吸盤吸附于水族缸壁，保持箱體底部離缸底10 cm左右以防止親魚產卵后吞噬魚卵。于傍晚時分將親魚放入布置好的繁殖箱中，雌雄比例2∶3，向繁殖缸中補充部分曝氣自來水以刺激親魚發(fā)情產卵。待親魚產卵后將其移出繁殖缸，用管口平滑圓潤大口吸管從缸底緩慢吸取質量良好的受精卵用于下一階段的實驗。

1.3單因素實驗

為獲得各因素的最佳取值范圍，首先進行單因素孵化實驗，每個因素水平設2個重復，隨機選取30粒受精卵于1 000 mL燒杯內進行人工孵化。為防止缺氧造成受精卵死亡，用吸管將受精卵輕輕吹散，使其均勻分布于燒杯底部，并不時利用吸管補充氧氣。在孵化過程中密切觀察受精卵的變化情況，及時挑出死卵，防止水霉的發(fā)生。

孵化水溫分別設置為24、26、28、30℃；pH值分別為6.5、7、7.5、8、8.5；光照強度分別為50、100、200、300、400 lx；光周期分別為8L∶16D（阿拉伯數為小時數，L為光照，D為黑暗避光，后同）、10L∶14D、12L∶12D、14L∶10D，實驗期間當某個組的光照時間結束后，立即將其移入遮光區(qū)域，其他組則繼續(xù)正常接受光照。

1.4正交實驗

在單因素實驗的基礎上根據正交實驗的設計原理，以受精卵孵化率為實驗目標，設置水溫、pH、光照強度和光照周期4個因素，每個因素設置3個水平，進行4因素3水平的正交實驗，具體因素水平見表1。實驗期間密切觀察受精卵胚胎的發(fā)育情況，并進行相應記錄，胚胎的發(fā)育分期參照Kimmel等的描述［5］。

1.5數據統計

按照下列公式計算各實驗組孵化率：

孵化率=出膜苗數/孵化卵數×100%對正交實驗所得實驗數據，采用極差法進行統計分析。

表1　正交實驗的因素與水平

2　結果

2.1單因素實驗

在設定的水溫范圍內，斑馬魚受精卵的孵化率為55%～85%，其中水溫24℃時孵化率最低，為55%。隨著水溫的升高，孵化率亦開始增加，并于28℃時達到峰值85%，隨后孵化率又逐漸下降，30℃水溫時孵化率為75%。不同pH條件下斑馬魚受精卵的孵化率亦有較大差異，當pH在6.5～7.5之間時，孵化率為81.7%～90%，呈上升趨勢。但當pH超過7.5時，孵化率則突然大幅下降，pH 8.0和8.5時的孵化率分別為75%和76.7%（圖1）。

圖1　不同水溫（■）和pH（●）下受精卵孵化

在設定的光照強度范圍內，50 lx時孵化率為88.3%，100 lx時孵化率達到最高，為91.7%。之后隨著光照強度的進一步增加，孵化率呈下降趨勢，400 lx時孵化率最低，為76.7%。在所設定的四組不同光周期中，10 h光照組（10L∶14D）孵化率最高，為71.7%；相較之下，14 h光照組（14L∶10D）孵化率最低，僅為45%（圖2）。

2.2正交實驗

根據L9（34）正交設計表，一共開展9個組合的實驗，具體結果見表2，其中A2B1C2D3組合孵化率最高，為85%。后續(xù)進行的極差分析顯示RA＞RB=RC＞RD，即四因素對斑馬魚受精卵孵化率的作用由大到小依次為：水溫，光照強度，pH，光照周期。根據K值推斷最佳孵化條件為A2B3C2D3，即水溫為28℃、pH 為8、光照強度為100 lx、光周期為12L∶12D時，斑馬魚受精卵的孵化率最高（表3）。

2.3斑馬魚的胚胎發(fā)育

圖2　不同光照強度（◆）和光周期（▌）下受精卵孵化率

實驗中受精卵孵化時間隨著孵化溫度的提高而縮短，且在發(fā)育過程中存在不同步現象。在28℃水溫條件下，從受精到出膜約需3 d左右時間，歷經受精卵期，卵裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期、咽部期和孵化期7個主要階段，每一階段歷時各不相同，其中受精卵期發(fā)生于0～0.75 h，卵裂期為0.75～2.5 h，囊胚期為2.5～6.0 h，原腸胚期為6～18 h，體節(jié)期為18～32 h，咽部期為32～46 h，孵化期為46～70 h。

3　討論

魚類受精卵的孵化涉及一系列復雜的生理、生化過程，會受到諸多因素的影響。水溫和pH值可直接影響各種孵化相關酶類的活性，進而對孵化進程產生作用［6-7］。孵化與接收光照的時間、強度也有密切的關系，這是因為充足的光照不但有利于水溫的提高，更重要的是可以消毒殺菌，使受精卵在孵化期間免遭水霉的侵害，而且光周期的變化可以直接啟動生物的節(jié)律［8-9］。

表2　正交實驗方案與結果

表3　極差分析表

通常，不同魚類適宜的孵化條件各不相同，即使同一種魚，在不同的環(huán)境條件中生存較長時間后，其適宜的生長、發(fā)育條件也會發(fā)生改變［10］。就斑馬魚而言，董武等［4］認為適宜的胚胎發(fā)育溫度為25～31℃，袁宗勤等［10］通過觀察比較斑馬魚受精卵在不同溫度條件下的病死率、孵化率等指標后，推斷28℃為最佳孵化溫度，與本研究結果一致。

目前尚無關于pH值、光照等對斑馬魚受精卵孵化率影響的研究報道，但在相關文獻中一般建議飼養(yǎng)斑馬魚時保持pH為7.0～8.0，光照強度為54～324 lx，光照期為14L∶10D［11-12］。本研究中，無論是單因素實驗還是正交實驗，適宜pH值和光照強度均在建議范圍之內，但適宜的光周期卻有所不同。單因素實驗中光周期為10L∶14D時孵化率最高，正交實驗中最佳孵化光周期則為12L∶12D，這可能與魚類的受精卵孵化不宜長時間光照有關，類似現象在大銀魚卵的孵化中也曾有過報道［13］。

本次研究中另一個值得注意的現象就是單因素實驗所得出的最佳孵化條件與通過正交實驗推斷的最佳孵化條件并不完全一致，除上述光周期之外，pH值也不相同，單因素實驗中pH值為7.5時孵化率最高，但在正交實驗中，pH值為8時孵化率最高，這可能是由于其他因素互作效應的影響。相較于單因素實驗每次只能關注于一個因素，正交實驗更適合于多因素多水平實驗條件的研究，只需選擇適當的正交表來安排實驗，即可找到諸多因素中對實驗指標有顯著影響的主要因素，并確定使實驗指標達到最佳的因素水平，而且相關結論具有更好的重復性［14］。目前，正交實驗已廣泛應用于許多領域生產工藝或條件的優(yōu)化［15］，不過在魚類受精卵孵化條件的優(yōu)化方面尚鮮有報道。此外，在孵化過程中，斑馬魚的胚胎發(fā)育存在不同步現象，且每一階段經歷的時間與Kimmel等的研究報道不完全一致，這可能與孵化條件不同有關。

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資助項目：江蘇省人畜共患病重點實驗室開放基金（R1510）；揚州大學大學生學術科技創(chuàng)新基金項目（x2015680）

中圖分類號：Q173

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2091（2016）07-0027-5

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.07.006

收稿日期：（2016-02-22）

作者簡介：陳楠（1993-），女，學士，研究方向為水產動物醫(yī)學；

通訊作者：付立霞，男，博士，E-mail:dynamicren@163.com

Effects of water temperature，pH and light on the hatching rate of zebrafish oosperm

Chen Nan，Gao Wen，Zhang Lei，Dong Luotao，Shen Zeen，Wei Wenzhi，Fu Lixia
（Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis，College of Animal Science，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：The effects of water temperature，pH and light intensity and period on the hatching rate of ze－brafish oosperm were explored by single factor experiments and orthogonal test.The optimum value for the four factors，deduced from the results of single factor experiments，were 28℃，7.5，100 lx and 10L∶14D，respectively，for the hatching rate in the condition of one of them was highest among their groups.However，the results of orthogonal test indicated that the best hatching condition could be the combination of 28℃，8，100 lx and 10L: 14D，and the influence order of individual factor was:water temperature＞pH＝light intensity＞light period.In the process of incubation，the hatching time became shorter with the increase of water temperature and asynchrony was observed in the development of zebrafish.

Key words：zebrafish；hatching rate；water temperature；pH；light