創(chuàng)傷性失血性休克對(duì)機(jī)體抗氧化水平影響的實(shí)驗(yàn)研究*

李大鵬，呂春雷，王永清，王鳳嬌，張　霞，翟真真，鄭文哲

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

創(chuàng)傷性失血性休克對(duì)機(jī)體抗氧化水平影響的實(shí)驗(yàn)研究*

李大鵬，呂春雷*，王永清，王鳳嬌，張霞，翟真真，鄭文哲

目的探討創(chuàng)傷性失血性休克（traumatic hemorrhagic shock，THS）對(duì)機(jī)體過(guò)氧化水平的影響。方法選擇普通級(jí)新西蘭兔11只，通過(guò)急性失血方式建立收縮壓下降曲線，形成THS動(dòng)物模型，在不同的休克時(shí)段測(cè)定收縮壓基礎(chǔ)值（T1），當(dāng)收縮壓降至基礎(chǔ)值2/3（T2）、基礎(chǔ)值1/2（T3）、基礎(chǔ)值1/3（T4）時(shí)采集血樣，采用酶聯(lián)免疫吸附分析檢測(cè)各位置血清過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）水平，并予以統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果CAT：A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，T1-T2、T2-T3、T3-T4各組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其余組間存在顯著性差異（P＜0.05）；GSH-Px：A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，T1、T2間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其余組間存在顯著性差異（P＜0.05）；T-AOC：各時(shí)間水平間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論選擇收縮壓下降曲線建立THS模型，THS發(fā)生過(guò)程對(duì)機(jī)體抗氧化酶CAT、GSH-Px具有顯著性影響，可致CAT、GSH-Px活性顯著下降，但對(duì)T-AOC無(wú)顯著性影響，失血量與CAT、GSH-Px指標(biāo)間存在顯著相關(guān)性。

創(chuàng)傷性失血性休克；抗氧化水平；抗氧化酶；過(guò)氧化氫酶；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；總抗氧化能力

［Abstract］ObjectiveTo study the influence of traumatic hemorrhagic shock（THS）on peroxidation levels of organism.MethodsThe THS model with gradient decerease in the systolic blood pressure was eatablished in 11 New Zealand rabbits（ordinary grade）.The arterial blood at the different phases of shock，i.e.when the decreased systolic pressures were 2/3（T2），1/2（T3），1/3（T4）of the basis systolic blood pressure，was sampled，then hydrogen peroxide enzyme（CAT），glutathione peroxidase（GSH-Px），total antioxidant capacity（T-AOC）levels in the plasmaweredeterminedbythedoubleantibodySandwichmethodofenzyme-labeledimmunosorbentassay（ELISH），and be statistically analysed.ResultsCAT：Group A was higher than group B，group B higher than group C，group C higher than group D；there was no significant difference between T1-T2，T2-T3，T3-T4among all groups（P＞0.05）.But there were significant differences among the other groups（P＜0.05）.GSH-Px：Group A was higher than group B，group B higher than group C，group C higher than group D；there was no significant difference between T1-T2among all group（P＞0.05）.But there were significant differences among other groups（P＜0.05）.T-AOC：There was no significant difference between all time-level（P＞0.05）.ConclusionIn selecting the systolic blood pressure decline curve toestablishTHSmodel，THSprocesshasasignificant effect onthe antioxidant enzyme CAT and GSH-Px of organism，can lead to significantly decreased of CAT and GSH-Px activity，but has no significant effect on the T-AOC；there are significantly correlation between blood loss and CAT，GSH-Px index.

［Keywords］Traumatichemorrhagicshock；Antioxidantlevels；Antioxidantenzyme；Hydrogenperoxide enzyme；Glutathione peroxidase；Total antioxidant capacity

創(chuàng)傷性失血性休克（traumatic hemorrhagic shock，THS）是院前急救中常見(jiàn)的急危重癥，微循環(huán)障礙是失血性休克所有監(jiān)測(cè)指標(biāo)中的核心評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)［1］。筆者通過(guò)快速失血形成收縮壓下降曲線方式建立THS模型，以抗氧化酶系統(tǒng)中過(guò)氧化氫酶（hydrogen peroxide enzyme，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，探討THS發(fā)生過(guò)程中不同失血量對(duì)機(jī)體抗氧化水平的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)選擇新西蘭兔（n=11），普通級(jí)，體重質(zhì)量2～3 kg，雌雄不限，購(gòu)于山東省濟(jì)南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）2015-0001］，普通環(huán)境［SYXK（軍）2012-0044］中沖洗式飼養(yǎng)兔籠（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備公司）內(nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。

1.2主要儀器與試劑ZH-HX-2型無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量分析系統(tǒng)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）用于血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)監(jiān)測(cè)，小動(dòng)物人工呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技公司）用于輔助呼吸等。

測(cè)定CAT、GSH-Px、T-AOC指標(biāo)主要儀器包括722型光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠，CAT測(cè)定為波長(zhǎng)405 nm、0.5 cm光徑比色杯，GSH-Px測(cè)定波長(zhǎng)412 nm、1 cm光徑比色杯，T-AOC檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm、1 cm光徑比色杯）、5415R臺(tái)式冷凍小型離心機(jī)、5810R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）等。CAT、GSH-Px、T-AOC測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

實(shí)驗(yàn)主要耗材：0.3%戊巴比妥鈉溶液（自配），肝素鈉注射液（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)1507104），0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào)2015092407），一次性使用塑料血袋（四川南格爾生物科技有限公司，批號(hào)150304）等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)新西蘭兔適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d以上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前24 h禁食、2～3 h禁水。

實(shí)驗(yàn)操作前，實(shí)驗(yàn)兔均先稱(chēng)重并記錄，并采集血標(biāo)本2ml以上待檢（常規(guī)方法迅速分離血清，-80℃保存）。選擇0.3%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為30 mg/kg體重，緩慢耳緣靜脈注射。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，麻醉過(guò)程可逐步追加1/5量，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)呼吸暫停者給予輔助呼吸至自主呼吸恢復(fù)。

麻醉穩(wěn)定后，將實(shí)驗(yàn)兔仰臥固定在解剖臺(tái)上，8%硫化鈉脫毛暴露手術(shù)區(qū)皮膚后常規(guī)消毒，手術(shù)方式仔細(xì)分離出兔右側(cè)頸總動(dòng)脈，完畢后插入肝素化動(dòng)靜脈插管并用縫合線固定好，肝素化抗凝（500 U/ kg），插管通過(guò)壓力轉(zhuǎn)換器與無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量分析系統(tǒng)相連，監(jiān)測(cè)血壓、心率等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化。無(wú)菌操作下，按以上方式分離出右側(cè)股動(dòng)脈進(jìn)行PE套管插管并用縫合線固定好以建立放血通路，并與一次性使用塑料血袋（或帶刻度定量收集管）相連，用于放血及血液標(biāo)本留取。

1.3.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽鋵?shí)驗(yàn)操作前，記錄實(shí)驗(yàn)兔收縮壓基礎(chǔ)值（T1）等指標(biāo)。選擇右側(cè)股動(dòng)脈建立的放血通路進(jìn)行放血，使用一次性使用塑料血袋收集，兔收縮壓隨放血量增加而逐步下降，形成收縮壓下降曲線。當(dāng)收縮壓降至基礎(chǔ)值2/3（T2）、1/2（T3）、1/3（T4）3個(gè)位置時(shí)，通過(guò)帶刻度定量收集管分別留取血標(biāo)本2 ml以上，按常規(guī)方法迅速分離血清，-80℃保存待檢。

1.4指標(biāo)測(cè)定CAT活性測(cè)定采用可見(jiàn)光法，嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品處理和實(shí)驗(yàn)操作，405 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度A，檢測(cè)范圍為0.2～24.8 U/ml。

GSH-Px活性測(cè)定采用DTND顯色法，嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品處理和實(shí)驗(yàn)操作，412 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度A，檢測(cè)范圍為20～330 U/ml。

T-AOC測(cè)定采用鐵還原-菲啉顯色法，嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品處理和實(shí)驗(yàn)操作，520 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度A，檢測(cè)范圍為0.2～55.2 U/ml。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。重復(fù)測(cè)量資料使用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

11只實(shí)驗(yàn)兔在T1～T4共4個(gè)位置采集血樣，檢測(cè)取得血清CAT、GSH-Px、T-AOC指標(biāo)數(shù)據(jù)，分別按A、B、C、D進(jìn)行分組，A～D各組指標(biāo)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

（1）CAT、GSH-Px、T-AOC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，其中CAT檢測(cè)A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，GSH-Px檢測(cè)A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，T-AOC檢測(cè)A組低于B組、B組高于C組、C組低于D組。

表1　各組CAT、GSH-Px、T-AOC檢測(cè)結(jié)果

（2）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較中，重復(fù)測(cè)量因素為時(shí)間因素，有T1、T2、T3、T4共4個(gè)水平。

CAT：檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行球型檢驗(yàn)，結(jié)果P=0.053＞0.05，不拒絕球形假設(shè)，應(yīng)用單變量檢驗(yàn)方法無(wú)須ε校正，結(jié)果見(jiàn)表2；對(duì)重復(fù)效應(yīng)進(jìn)行方差分析（F檢驗(yàn)），結(jié)果見(jiàn)表3，表明各時(shí)間水平間存在顯著性差異（P＜0.001）。采用LSD法對(duì)各時(shí)間水平間進(jìn)行多重比較，結(jié)果見(jiàn)表4，其中T1-T2、T2-T3、T3-T4各組檢驗(yàn)結(jié)果P＞0.05，其余各組間均P＜0.05，表明T1-T2、T2-T3、T3-T4各組間無(wú)顯著性差異，其他組間存在顯著性差異。

GSH-Px：檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行球型檢驗(yàn)，結(jié)果P= 0.257＞0.05，不拒絕球形假設(shè)，應(yīng)用單變量檢驗(yàn)方法無(wú)須ε校正，結(jié)果見(jiàn)表2；對(duì)重復(fù)效應(yīng)進(jìn)行方差分析（F檢驗(yàn)），結(jié)果見(jiàn)表3，表明各時(shí)間水平間存在顯著性差異（P＜0.001）。采用LSD法進(jìn)行各時(shí)間水平間多重比較，結(jié)果見(jiàn)表5，T1-T2間檢驗(yàn)結(jié)果P＞0.05，其余各組間均P＜0.05，表明T1、T2間無(wú)顯著性差異，其余組間存在顯著性差異。

表2　球型檢驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析結(jié)果

表4　CAT不同時(shí)間水平下LSD多重比較結(jié)果

表5　GSH-Px不同時(shí)間水平下LSD多重比較結(jié)果

T-AOC：檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行球型檢驗(yàn)，結(jié)果P= 0.110＞0.05，不拒絕球形假設(shè)，應(yīng)用單變量檢驗(yàn)方法無(wú)須ε校正，結(jié)果見(jiàn)表2；對(duì)重復(fù)效應(yīng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，表明各時(shí)間水平間無(wú)顯著性差異（P=0.103＞0.05）。

3　討論

失血性低血容量休克主要病理生理改變是有效循環(huán)血容量急劇減少及微循環(huán)障礙，可導(dǎo)致組織低灌注、再灌注損傷等［2］。氧化應(yīng)激是機(jī)體最常見(jiàn)的應(yīng)激反應(yīng)之一，系指在損傷因素作用下，機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增多和（或）清除能力降低，導(dǎo)致氧自由基在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積，出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化及造成細(xì)胞或組織氧化損傷［3，4］。

抗氧化酶是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的主要組成。CAT可有效清除自由基、減輕及阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、還原體內(nèi)不斷生成的過(guò)氧化氫、產(chǎn)生保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整等作用，可間接反映抗氧化酶的活性及機(jī)體清除自由基的能力；GSH-Px作為清除自由基的抗氧化制劑，可還原體內(nèi)不斷生成的脂質(zhì)過(guò)氧化物和過(guò)氧化氫，減少活性氧自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生，清除自由基和衍生物，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，防止脂質(zhì)過(guò)氧化物對(duì)機(jī)體組織造成損害，產(chǎn)生保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。T-AOC是衡量抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，其含量能反映機(jī)體抗氧化系統(tǒng)針對(duì)外來(lái)刺激的代償能力及自由基代謝的狀況［5-11］。

機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)及抗氧化水平易受到多種因素影響［11，12］。筆者建立的THS模型，存在研究THS發(fā)生過(guò)程對(duì)機(jī)體抗氧化水平的影響。檢測(cè)數(shù)據(jù)表明：隨THS發(fā)生過(guò)程中失血量逐步增加，抗氧化酶CAT、GSH-Px活性均不斷下降。CAT組間比較，T1-T2、T2-T3、T3-T4各組間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其余組間存在顯著性差異（P＜0.05）；GSH-Px組間比較，T1、T2間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其余組間存在顯著性差異（P＜0.05）；T-AOC組間比較，各時(shí)間水平間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。表明失血量大量增加對(duì)CAT、GSH-Px指標(biāo)具有顯著性影響，可致抗氧化酶CAT、GSH-Px活性顯著下降，但對(duì)反映抗氧化系統(tǒng)功能狀況綜合性指標(biāo)T-AOC則無(wú)顯著性影響。THS發(fā)生過(guò)程中失血量與CAT、GSH-Px指標(biāo)活性具有顯著相關(guān)性。

實(shí)驗(yàn)表明，隨著THS發(fā)生過(guò)程中有效循環(huán)血容量急劇減少及微循環(huán)障礙，可導(dǎo)致組織低灌注、再灌注損傷，使機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增多，過(guò)量自由基水平可致抗氧化酶CAT、GSH-Px消耗增加，顯著降低血清中CAT、GSH-Px活性水平，使機(jī)體清除自由基能力及抗氧化能力下降，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)上調(diào)，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化并導(dǎo)致機(jī)體生物膜損傷。

總之，筆者通過(guò)快速失血方式建立THS模型，以CAT、GSH-Px及T-AOC為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，探討及評(píng)價(jià)THS發(fā)生過(guò)程中不同失血量對(duì)機(jī)體抗氧化水平的影響，數(shù)據(jù)表明THS發(fā)生過(guò)程中不同失血量對(duì)CAT、GSH-Px指標(biāo)具有顯著性影響，可顯著降低血清CAT、GSH-Px活性水平，使機(jī)體清除自由基能力及抗氧化能力下降，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)上調(diào)，但對(duì)TAOC水平則無(wú)顯著性影響，為院前THS救治及相關(guān)研究提供了數(shù)據(jù)支持。

今后仍有待于進(jìn)一步增加實(shí)驗(yàn)研究數(shù)量，結(jié)合開(kāi)展相關(guān)生理病理等機(jī)理機(jī)制研究，并在THS復(fù)蘇救治等工作中不斷加以推廣。

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［本文編輯：韓仲琪］

Experimental study on the influences of traumatic hemorrhagic shock on antioxidant levels of organism

LI Da-peng①，LV Chun-lei，WANG Yong-qing，et al.①Central Medical Laboratory，the 88th Hospital of Chinese PLA，Taian，Shandong 271000，China

R641：R441.9

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.07.018

軍隊(duì)“十二五”后勤科研計(jì)劃項(xiàng)目（CWS11J297）

271000山東泰安，解放軍88醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（李大鵬，王鳳嬌，張霞，翟真真），醫(yī)務(wù)處（呂春雷，王永清，鄭文哲）

呂春雷，Email：15653808901@163.com