IC法快速同時測定低分子右旋糖酐氨基酸注射液中EDTA和NaHSO3的含量

余燕，梁蔚陽

(廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510180)

IC法快速同時測定低分子右旋糖酐氨基酸注射液中EDTA和NaHSO3的含量

余燕，梁蔚陽Δ

(廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510180)

目的建立一種離子色譜抑制電導法，用于快速測定低分子右旋糖酐氨基酸注射液中EDTA和NaHSO3的含量。方法采用Dionex的陰離子交換色譜柱IonPac AS11-HC和IonPac AH11-HC保護柱對樣品進行分離，以13 mmol/L的KOH溶液為淋洗液，流速為1.0 mL/min抑制性電導檢測器檢測。抑制電流為70 mA，電導檢測器溫度為35 ℃，樣品經稀釋后直接經自動進樣器進樣。結果實驗表明，EDTA和NaHSO3分別在1.25～20.12、3.86～61.82(g/m范圍內線性關系良好(R>0.9990)，2者平均回收率分別為100.89%、95.3%。結論該方法準確，簡便快速，選擇性高，重現性好，可用于低分子右旋糖酐氨基酸注射液中EDTA和NaHSO3的含量的快速同時檢測。

離子色譜；低分子右旋糖酐氨基酸注射液；EDTA；NaHSO3

作為一種重要復方制劑，低分子右旋糖酐氨基酸注射液常用于治療兼有蛋白質缺乏的血容量減少患者。該注射液是由右旋糖酐40和包括色氨酸、亮氨酸、胱氨酸等11種氨基酸制成的滅菌水溶液，因所含色氨酸、胱氨酸性質不穩定，在光照或遇氧化劑條件下易被氧化，故處方中加入了NaHSO3及EDTA二鈉(以下簡稱EDTA)。NaHSO3及EDTA是醫藥工業中常用的輔料，其中前者為抗氧化劑，后者則可與金屬離子形成穩定的水溶性絡合物，從而降低右旋糖酐40與金屬離子間的氧化反應，提高藥物的穩定性。但微過量的NaHSO3可使患者短時間內發生過敏反應，造成肝功能患者轉氨酶升高甚至肝壞死[1-2]；同樣過量的EDTA也會引起患者惡心、頭痛、尿急、血液凝固性降低甚至心臟停搏等不良反應[3-6]。因此，對注射用藥物中NaHSO3及EDTA輔料的用量控制成為藥品質量控制的關鍵之一。目前NaHSO3及EDTA的測定方法多采用電位滴定法、液相色譜法、氣相色譜法等[7-13]。其中電位滴定法選擇性差、靈敏度低；液相和氣相檢測耗時長、檢測成本高，不利于批量檢測。離子色譜法(IC)具有操作簡便、靈敏度高、可同時測定多組分等優點，在醫藥食品檢測行業中得到越來越廣泛的重視，如《中國藥典》(2010年版)在新增的3個附錄中其中就有離子色譜被一二三部附錄同時收載。

本文在建立對NaHSO3及EDTA同時檢測的IC法基礎上，對委托檢驗樣品中2者的含量進行測定，以控制低分子右旋糖酐氨基酸注射液的質量，排除用藥安全的潛在隱患。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 美國Dionex ICS-2000型離子色譜儀(配有EGC Ⅱ KOH自動淋洗液發生器，AS40自動進樣器)。試驗用水由Mili Pore超純水機制備，電阻率為18.2MQ·cm。

NaHSO3對照品(購自廣州化學試劑廠，批號20110102-2，含量95.12%)、EDTA對照品(購自廣州化學試劑廠，批號20110201-1，分子量372.24，含量99.0%)、低分子右旋糖酐氨基酸注射液(由廣東韶關麗珠集團利民制藥廠送檢，批號為1102032及1102038，規格為100 mL)

1.2 方法

1.2.1 色譜柱及色譜條件：陰離子交換色譜柱AS11分析柱：IonPac AS11-HC (4×250 mm)，Dionex公司；保護柱：IonPac AH11-HC (4×50 mm)，Dionex公司；淋洗液：KOH溶液(13 mmol/L)；淋洗液罐：EGCⅡ KOH(序列號090581489019)；抑制型電導檢測器：ASRS 400 4 mm；抑制電流：70 mA；自動進樣器：AS40 Automated Sampler；進樣量：25uL；柱溫：35 ℃。

1.2.2 儲備液、混合對照品溶液及供試品溶液的配置：對照品儲備液的配制：精密稱取EDTA對照品0.05059g置100 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，作為EDTA對照品儲備液1；再精密量取1 mL至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。精密稱取NaHSO3對照品0.15990g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為NaHSO3對照品儲備液2。

混合對照品溶液的配制：分別精密量取對照品儲備液1、2各1 mL至100 mL量瓶中，用水定量稀釋制成每1 mL中分別約含EDTA 5 μg和NaHSO316 μg的溶液作為混合對照品溶液。

供試品溶液的配制：精密量取本品1 mL置50 mL量瓶中，加水定容，經0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

1.2.3 線性關系考察：分別取EDTA 和NaHSO3對照品儲備液，分別精密量取0.5 mL至200 mL量瓶、0.5 mL至100 mL量瓶、1 mL至100 mL量瓶、2 mL至100 mL量瓶、4 mL至100 mL量瓶；然后分別加水溶解、定量稀釋制成每1 mL分別含EDTA 1.25、2.5、5、10、20 μg，以及每1 mL含NaHSO34、8、16、32、64 μg的溶液，分別作為對照品溶液S1、S2、S3、S4、S5。分別以EDTA和NaHSO3的峰面積對濃度進行線性回歸。

1.2.4 精密度試驗：取其中一批(批號為1102032)的供試品溶液，連續進樣6次，計算EDTA和NaHSO3峰面積的RSD。

1.2.5 重復性試驗：取批號為1102032同批注射液6份，分別進樣，計算峰面積的RSD。

1.2.6 穩定性試驗：取批號為1102032含量測定下的樣品，放置1、2、4、8、12、24、48h后測定EDTA和NaHSO3峰面積的RSD。

1.2.7 加樣回收率試驗：精密移取批號為1102032樣品0.5 mL至100 mL量瓶中，共9份，平均分成3組，分別加入EDTA對照品儲備液和NaHSO3儲備液300、500、700 μL。計算EDTA和NaHSO3的回收率、平均回收率和RSD。

1.2.8 檢測限試驗：將EDTA和NaHSO3對照品儲備液按照比例定量稀釋，以信噪比(s/n=3)時，測定EDTA和NaHSO3的檢測限濃度。

1.2.9 樣品測定：取送檢的2批樣品，量取1 mL至50 mL量瓶中并定容，并依建立的IC檢測方法測定。

2 結果

2.1 線性回歸方程 經計算EDTA的線性方程為：y=0.0395x-0.0327(R=0.9990)；NaHSO3的線性方程為：y=0.1438x-0.3908(R=0.9993)。表明EDTA在1.25～20.03 μg/mL范圍內、NaHSO3在3.82～60.84 μg/mL范圍內均具有良好的線性關系。

2.2 精密度試驗 批號為1102032的供試品溶液，連續進樣6次，計算得EDTA和NaHSO3峰面積的RSD分別為0.35%和0.53%。

2.3 重復性試驗 批號為1102032同批注射液6份，分別進樣后峰面積的RSD為0.89%。

2.4 穩定性試驗 批號為1102032含量測定下的樣品，在放置1、2、4、8、12、24、48 h后測定結果顯示EDTA峰面積的RSD為1.49%、NaHSO3峰面積的RSD為0.87%，表明樣品在48 h內穩定。

2.5 加樣回收率試驗 結果顯示，EDTA的回收率為99.4%～102.3%，平均回收率為100.8%，RSD為1.30% ；NaHSO3的回收率為94.2%～96.6%，平均回收率為95.3%，RSD為0.93%。表明該方法測定低分子右旋糖酐氨基酸注射液中NaHSO3和EDTA的含量回收率較好。

2.6 檢測限試驗 結果顯示，EDTA的檢測限濃度為0.1 μg/mL，NaHSO3的檢測限濃度為0.06 μg/mL。

2.7 樣品測定 批號1102032 EDTA的含量為4.6%，NaHSO3的含量為10.2%；批號1102032 EDTA的含量為4.5%，NaHSO3的含量為9.8%。

3 討論

已有部分文獻對不同藥物中的EDTA及NaHSO3進行IC檢測，如容彥華等[7]以10 mmol/L Na2CO3+1 mmol/L NaHCO3混合溶液為淋洗液，檢測卡絡磺鈉氯化鈉注射液中NaHSO3的含量；李恒等[8]以5 mmol/L Na2CO3+1 mmol/L NaHCO3混合溶液為淋洗液測定氨甲環酸注射液中EDTA的含量。筆者發現采用傳統的Na2CO3/NaHCO3淋洗液進行分析時，背景電導較高，且EDTA和SO32-峰形較差。由于EDTA峰值和峰面積相對較小，且與相鄰的Cl-峰及NO3-峰保留時間非常接近，造成實際檢測上的困難；同樣SO32-峰與由于氧化產生的少量SO42-峰保留時間也非常接近，區分難度較大。筆者從進樣的穩定性、淋洗液成分與配比的優化開展大量試驗，最終采用自動精準的在線淋洗液發生器，克服了人工配置淋洗液帶來的擾動；并改用電導較低的KOH淋洗液，在保證背景噪聲穩定的同時，最大限度降低了背景電導值，檢測峰對稱性及峰形得以改善，EDTA及SO32-峰的分離度顯著提高。見圖1。

圖1 IC同時檢測EDTA和NaHSO3Fig.1 Detection of EDTA and NaHSO3 simultaneously

淋洗液濃度是影響陰離子分離效果的另一個重要因素，當淋洗液濃度為4 mmol/L KOH溶液，NaHSO3對應峰與少量由于氧化生成的NaHSO4雜質峰重疊嚴重，當溶液濃度提高到6～10 mmol/L時，EDTA峰形較差，當KOH淋洗液濃度大于15 mmol/L，EDTA對應峰與Cl-、NO3-等雜質峰重疊嚴重。經反復摸索，確定最佳淋洗液濃度為13 mmol/L，在該濃度淋洗液下EDTA2-、SO32-、Cl-、SO42-等多種陰離子可良好分離，與其他雜質峰也無顯著干擾，能很好的同時對低分子右旋糖酐氨基酸注射液使用的金屬離子螯合劑EDTA和抗氧化劑NaHSO3進行監測。

需要指出的是，雖然亞硫酸鈉和EDTA作為穩定劑可以保持藥品的穩定性在多種注射液中應用，如奧拉西坦注射液、氨甲環酸注射液、硫酸依提米星注射液及中藥注射劑，但隨之而來的副反應更加需要關注，如有研究表明亞硫酸鈉對多種生命物質有影響，與染色體的交聯反應可能是副反應的主要原因[14]，美國FDA已正式要求廠家明確標出藥品中所添加的抗氧化劑含量及臨床副作用，更有甚者如歐洲的愛爾蘭等國家已禁止含亞硫酸鹽的氨基酸溶液在臨床上的使用[15]。而我國現有國家標準和行業標準均未有EDTA及NaHSO3的限度控制，且不同企業在實際生產中加入抗氧化劑的量差異較大，從檢測方法的可靠性、藥品使用的安全性并參考國外相關藥品質量控制標準，結合我國現有企業技術工藝水平，筆者推薦以2%和4%作為目前EDTA及NaHSO3輔料控制限值。

[1] 李琉，蘭文，王偉姣.IC法測定鹽酸多巴酚丁胺注射液中亞硫酸氫鈉的含量[J].中南藥學，2013，11(1)：58-60.

[2] 胡容融.氨基酸輸液中抗氧劑亞硫酸鹽的控制與測定[J]. 廣東藥學院學報，2001，17(4)：283-284.

[3] 呂蓓蓓，李濤，田靜，等.離子色譜法同時測定奧拉西坦注射液中微量EDTA及磷酸根離子[J].藥物分析雜志2011，31(5)：987-989.

[4] 陳飛東，戴志遠.食品中亞硫酸鹽測定方法的研究進展[J].食品研究與開發，2006，27(8)：139-142.

[5] 黃惠玲，王玉健，卓海華，等.食品中亞硫酸鹽的離子色譜法測定[J].分析實驗室，2009，28(8)：15-17.

[6] 趙常志，郭震，赫春香，等.殼聚糖修飾玻碳電極卷積伏安法測定環境水中的EDTA[J].分析試驗室，2003，22(3)：38-42.

[7] 容彥華，周桂榮，單玉富，等.IC法測定卡絡磺鈉氯化鈉注射液中NaHSO3的含量[J].藥物分析雜志，2011，31(1)：160-162.

[8] 李恒，晏菊姣，黃京芳.離子色譜法測定氨甲環酸注射液中EDTA的含量[J].藥物分析雜志2012 32(9)1684-1686.

[9] 劉軍玲， 張亞中. 離子色譜法測定白花蛇舌草注射液中亞硫酸鹽與硫酸鹽總量[J].安徽醫藥， 2013， 17(5)：769-770.

[10] 潘廣文， 姜振邦， 李仁勇. 離子色譜法檢測牙膏中的亞硫酸鹽[J].化學分析計量， 2014，23(S1)： 38-39.

[11] 邵宏宏， 周向陽， 周秀錦， 等. 離子色譜法測定水產品中亞硫酸鹽的含量[J].浙江海洋學院學報(自然科學版)，2011， 30(4)： 326-330.

[12] 王欣美， 毛秀紅， 王柯. 離子色譜法同時測定中藥注射劑中亞硫酸鹽及枸櫞酸含量的研究[J].中國衛生檢驗，2012， 22(3)： 470-472.

[13] 韋敏， 肖億. 反相高效液相色譜法測定硫酸依替米星滴眼液的含量[J].醫學文選， 2006， 25(1)： 15-17.

[14] 林娟紅， 戚榮平， 姚超英. 離子色譜法測定復方氨基酸注射液中亞硫酸根的含量[J]. 現代科學儀器， 2013， 10(5)：110-119.

[15] Shapiro R,Gazit A.Crosslinking of nucleic acids and proteins by bisulfite[J].Adv Exp Med Biol,1997,86A: 633-640.

(編校：吳茜)

DeterminationofsodiumhydrogensulfiteandEDTAindextran40andaminoacidsinjectionbyionchromatography

YU Yan, LIANG Wei-yang
(Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China)

ObjectiveTo develop a suppressed conductivity ion chromatography method for the determination of antioxidant sodium bisulfite and EDTA in dextran 40 and amino acids injection.MethodsAn IonPac AS11-HC anion column was used, with 13 mmol/L potassium hydroxide solution as eluent and using suppressed conductivity detector. The current rate was controlled to 1.0 mL/min and electric current was 70 mA. The samples were injected by automatic sampler after diluted.ResultsThe calibration curve for sodium bisulfite was linear in the range of 1.25-20.12 and 3.86-61.82(g/L) respective to antioxidant sodium bisulfite and EDTA(R>0.9990). The average recovery was 100.89% and 95.3%.ConclusionThe method developed was accurate and convenient. It also has the characteristics of high selectivity and good reproducibility. This method is available for the determination of antioxidant sodium bisulfite and EDTA in dextran 40 and amino acids injection.

ion chromatography; dextran 40 and amino acids injection; sodium bisulfite; EDTA

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.005

廣東省科技計劃項目(2014A020218011，、2016A040403076)；越秀區科技計劃項目(2015-PT-004)

余燕，女，碩士，主管藥師，研究方向：生檢生化，E-mail：494409425@qq.com；梁蔚陽，女，碩士,主任藥師，研究方向：生檢生化，E-mail：wl_1023@163.com

R453.9

A