丹皮酚對佐劑性關節炎模型大鼠關節炎5-羥色氨酸及白介素族的影響

石磊，王建杰，周成福,Δ

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 骨一科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學 基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

丹皮酚對佐劑性關節炎模型大鼠關節炎5-羥色氨酸及白介素族的影響

石磊1，王建杰2，周成福1,2Δ

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 骨一科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學 基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的探討佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型應用丹皮酚對關節炎5-羥色氨酸及白介素族的影響。方法選取SD大鼠100只，雌雄各半，隨機分為空白對照組、模型組、雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組，各20只。各組均采用弗氏完全免疫佐劑左后足趾皮內注射建立AA大鼠模型，并給予相應的藥物治療。觀察所有大鼠足爪腫脹度、關節炎指數、血清炎癥細胞因子及類風濕因子(RF)、5-羥色氨酸(5-HTP)水平、血清氧化應激相關指標水平。結果治療后，與模型對照組比較，各組大鼠d 16、d 20、d 24時足爪腫脹度較低，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)；各組大鼠d 16、d 20、d 24時關節炎指數(arthritis index，AI)評分較低，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)；各組大鼠ESR及血清C反應蛋白(CRP)、RF、5-HTP水平較低，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)；各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6水平較低，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)；血清IL-2水平較高，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組>丹皮酚低劑量組(P<0.05)；各組大鼠血清丙二醛(MDA)、NO水平較低，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組； 超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平較高，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組>丹皮酚低劑量組(P<0.05)。結論丹皮酚能夠明顯降低AA大鼠模型血清5-HTP及IL-1、IL-6水平，提高血清IL-2水平，發揮抗炎鎮痛作用，同時能夠抑制氧化應激反應，作用具有劑量依賴性。

佐劑性關節炎大鼠模型；丹皮酚；關節炎指數；5-羥色氨酸；白介素族

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身自身免疫性疾病，主要表現初期為關節腫脹、游走性疼痛、晨僵、活動受限等，晚期可發展為關節畸形[1]。RA在40～60歲女性人群高發，全世界發病率為0.5%～1%，在我國約為0.4%～1.0%，且呈逐年上升趨勢[2]，未規范治療的患者3年致殘率高達70%[3]，可見，RA具有發病率高、致殘率高等特點，對患者的生活質量和身心健康造成嚴重影響。該病病程較長，遷延難愈，目前尚無特效療法，臨床上主要采用非甾類抗炎藥、抗風濕藥、糖皮質激素、中藥制劑等進行治療[4]，前三類藥物往往副作用較大，而中藥制劑以作用靶點多、安全性高等特點具有獨特優勢。丹皮酚提取自中藥丹皮，具有解熱、鎮痛、抗炎、保護肝腎、抗腫瘤等多種作用[5]。本研究主要探討丹皮酚對佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型5-羥色氨酸及白介素族的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選取4周齡SPF級健康SD大鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002)100只，雌雄各半，體質量90.10～97.83g，平均體質量(95.43±12.45)g。將大鼠置于鼠籠中，采用自然光照，溫度控制在18 ℃～22 ℃，濕度約50%，給予充足飲水、標準飼料，自由活動與進食，進行適應性飼養1周。

1.1.2 主要藥品與試劑：丹皮酚，購自南京春秋生物工程有限公司，純度≥98%，CAS編號：552-41-0；雷公藤多苷片，購自江蘇美通制藥有限公司，國藥準字Z32021007；弗氏完全免疫佐劑(含卡介苗)(Freund’s complete adjuvant，FCA)，購自上海北諾生物科技有限公司；戊巴比妥鈉，購自北京普博斯生物科技有限公司；C反應蛋白(C reactive protein，CRP)、類風濕因子(rheumatoid factors，RF)、5-羥色氨酸( 5-Hydroxytryptophan，5-HTP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1(interleukin 1，IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒，購自上海嵐派生物科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(TBA法)，購自上海信裕生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、NO檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxydase，GSH-PX)測定試劑盒(比色法)，上海索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設備：Allegra X-5臺式離心機、AU5800全自動生化分析儀，美國貝克曼庫爾特有限公司產品； Thermo 902-ULTS超低溫冰箱，美國賽默飛世爾科技公司產品；AP-960全自動酶聯免疫分析儀，日本協和醫藥株式會社產品。

1.2 方法

1.2.1 造模及實驗方法[6]：將所有大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組、模型組、雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組共5組，每組各20只，雌雄各半。模型組、雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠分別給予FCA 0.1 mL左后足趾皮內注射致炎，空白對照組大鼠給予0.1 mL 0.9% NaCl溶液左后足趾皮內注射，觀察到足趾出現繼發性免疫炎癥反應，表現為對側后肢及雙前肢足爪腫脹且進行性加重，有炎性結節、紅斑出現，分布于尾部及耳部，提示AA大鼠模型建立成功；致炎12 d后，采用灌胃給藥方式，雷公藤多苷組給予濃度為10 mg/mL雷公藤多苷10 mL/(kg·d)，丹皮酚高劑量組給予濃度為20 mg/mL的丹皮酚10 mL/(kg·d)，丹皮酚低劑量組給予濃度為10 mg/mL的丹皮酚10 mL/(kg·d)，空白對照組、模型組分別給予0.9%NaCl溶液10 mL/(kg·d)；連續給藥12 d。實驗過程中，無大鼠意外死亡情況發生。

1.2.2 足爪腫脹度及關節炎指數評分觀察：分別于d 12、d 16、d 20、d 24，觀察足爪腫脹度及關節炎指數評分。采用排水法[7]檢測右踝關節(非致炎側)容積，腫脹度=致炎后關節容積-致炎前關節容積；關節炎指數(arthritis index，AI)評分標準[8]：踝關節無異常為0分；小趾關節紅腫為1分；趾關節、足趾均發生腫脹為2分；踝關節以下的足爪發生腫脹為3分；全部足爪腫脹(包括踝關節)為4分。大鼠的AI為各個關節積分總和。

1.2.3 標本取材：最后一次用藥結束后4 h，采用3%戊巴比妥鈉0.3 mL/kg對大鼠進行麻醉，取頸總動脈血，取2 mL置于抗凝管中，采用魏氏法觀測紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)情況；剩余血液放置20min，采用離心機3000r/min離心10min分離血清，置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 血清炎癥細胞因子及RF、5-HTP水平檢測：取3mL大鼠血清，采用全自動酶聯免疫分析儀，按照試劑盒說明書操作，通過ELISA法檢測血清CRP、RF、5-HTP、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平。

1.2.5 血清氧化應激相關指標水平：取3 mL大鼠血清，采用全自動生化分析儀，按照試劑盒說明書操作，檢測血清MDA、SOD、 NO 、GSH-PX水平。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時間足爪腫脹度比較 與空白對照組比較，各組大鼠d 12、d 16、d 20、d 24時的足爪腫脹度較高(P<0.05)；與模型組比較，d 16、d 20、d 24時雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠足爪腫脹度較低(P<0.05)，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間足爪腫脹度比較Tab.1 Comparison of foot swelling degree among each group at different

*P<0.05，與空白對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared withmodel group；△P<0.05，與雷公藤多苷組比較，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，與丹皮酚高劑量組比較，compared withpaeonol high dose group

2.2 各組大鼠不同時間AI評分比較 與模型組比較，d 16、d 20、d 24時雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠的AI評分較低(P<0.05)，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時間AI評分比較分)Tab.2 Comparison of AI evaluation among each group at different time points (n=20，±s， points)

#P<0.05，與模型組比較，compared withmodel group；△P<0.05，與雷公藤多苷組比較，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，與丹皮酚高劑量組比較，compared withpaeonol high dose group

2.3 各組大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平比較 與空白對照組比較，各組大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平較高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平較低(P<0.05)，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平比較Tab.3 Comparison of serum CRP, RF and 5-HTP levels among each group at different time points(n=20，±s)

*P<0.05，與空白對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared withmodel group；△P<0.05，與雷公藤多苷組比較，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，與丹皮酚高劑量組比較，compared withpaeonol high dose group

2.4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 與空白對照組比較，各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平較高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平較低，血清IL-2水平較高(P<0.05)，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組血清TNF-α、IL-1、IL-6水平低于丹皮酚低劑量組，雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組血清IL-2水平高于丹皮酚低劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平比較Tab.4 Comparison of serum TNF-α,IL-1,IL-2 and IL-6 levels among each group at different time points (n=20，±s， pg/mL)

*P<0.05，與空白對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared withmodel group；△P<0.05，與雷公藤多苷組比較，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，與丹皮酚高劑量組比較，compared withpaeonol high dose group

2.5 各組大鼠血清氧化應激相關指標水平比較 與空白對照組比較，各組大鼠血清MDA、NO水平較高，SOD、GSH-PX水平較低(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠血清MDA、NO水平較低，SOD、GSH-PX水平較高(P<0.05)，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組血清MDA、NO水平低于丹皮酚低劑量組，雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組血清SOD、GSH-PX水平高于丹皮酚低劑量組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠血清MDA、SOD、NO、GSH-PX水平比較Tab.5 Comparison of serum MDA,SOD,NO and GSH-PX levels among each group at different time points (n=20，±s)

*P<0.05，與空白對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared withmodel group；△P<0.05，與雷公藤多苷組比較，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，與丹皮酚高劑量組比較，compared withpaeonol high dose group

3 討論

丹皮酚是中藥丹皮的有效成分[9]，丹皮能夠涼血清熱、活血化瘀，藥理研究顯示，丹皮酚藥理作用多樣，能夠保護肝腎、抗菌消炎、鎮痛、抗腫瘤、清除自由基、抗抗過敏、保護心血管等[10]。Hyuk Soon Kim等[11]采用丹皮酚干預體外反轉錄聚合酶作用下的炎癥反應，結果發現，其能夠有效抑制炎癥反應相關基因的表達；顏貴明等[12]采用丹皮酚對內毒素致慢性阻塞性肺疾病大鼠模型進行干預，結果發現丹皮酚能夠通過抗炎、抗氧化等作用抑制大鼠氣道重構。可見，丹皮酚確實具有良好的抗炎作用，但關于其治療RA的研究尚不多見，所以，本次研究采用弗氏完全免疫佐劑局部注射致炎建立AA大鼠模型，來探討丹皮酚對RA的影響。本研究結果顯示，與模型組比較，d 16、d 20、d 24時雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠足爪腫脹度及AI評分較低，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)，表明丹皮酚能夠有效抑制模型大鼠繼發性炎癥，減輕關節腫脹癥狀，且作用效果與劑量正相關。

ESR、CRP、RF是RA常見的實驗室檢查指標，對RA有早期診斷價值[13]。ESR為紅細胞沉降率，其水平類風濕的活動度正相關，可以用來評價RA活動度以及治療效果；CRP是急性時相蛋白，是反映炎癥反應程度的早期、敏感指標，臨床意義與ESR一致；RA是一種自身免疫性疾病，RF則是將自身免疫球蛋白作為靶抗原的自身抗體，參與炎癥反應，是診斷RA常規檢查指標[14]。5-HTP 是5-羥色胺(5-HT)的前體物質，可以反映5-HT的水平，而5-HT為一種神經遞質，也是外周致痛因子，能夠刺激神經末梢直接導致疼痛的產生[15]。本研究結果顯示，與模型組比較，雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平較低，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組(P<0.05)，表明丹皮酚具有良好的抑制炎癥活動度及鎮痛作用。

炎癥反應是RA最主要的病理變化，白細胞介素及TNF-α是參與炎癥反應常見的細胞因子。IL-1及TNF-α具有激活血管內皮細胞，促進其與粘附分子結合，加重炎癥反應的作用；IL-6能夠促進B細胞增殖、分泌抗體誘發炎癥反應及免疫功能紊亂；三者均為促炎細胞因子；IL-2則屬于T細胞生長因子，可以調控免疫應答，其水平升高可減慢炎性細胞因子的致炎效應[16]。本研究結果顯示，與模型組比較，雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平較低，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組；血清IL-2水平較高，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組>丹皮酚低劑量組(P<0.05)，表明苦參堿能夠降低AA大鼠模型血清TNF-α、IL-1、IL-6水平，提高血清IL-2水平，有效減輕炎癥反應。

氧化應激反應也在RA關節損傷過程中起到重要作用[17]。MDA是脂質過氧化產物，NO具有自由基特征，可產生細胞毒性誘發免疫損傷，二者與氧化應激反應程度正相關；SOD、GSH-PX均具有清除自由基的功能，其水平可以反映機體抗氧化能力。本研究結果顯示，與模型組比較，各組大鼠血清MDA、NO水平較低，SOD、GSH-PX水平較高，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組，血清MDA、NO水平低于丹皮酚低劑量組，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組<丹皮酚低劑量組；雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組血清SOD、GSH-PX水平高于丹皮酚低劑量組，其中雷公藤多苷組、丹皮酚高劑量組>丹皮酚低劑量組(P<0.05)，表明丹皮酚能夠減輕AA大鼠氧化應激反應，減少其造成的組織損傷。

綜上所述，丹皮酚能夠明顯降低AA大鼠模型血清5-HTP及IL-1、IL-6水平，提高血清IL-2水平，發揮抗炎鎮痛作用，同時能夠抑制氧化應激反應，作用具有劑量依賴性，為丹皮酚用于RA的治療提供實驗基礎。

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(編校：王儼儼)

Effectofpaeonolon5-hydroxytryptophanandinterleukinfamilyofadjuvantarthritisratmodelwitharthritis

SHI Lei1, WANG Jian-jie2, ZHOU Cheng-fu1,2Δ
(1.Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

ObjectiveTo analysis the effect of Paeonol on 5- hydroxytryptophan(5-HTP) and interleukin family of adjuvant arthritis (AA) rat model.MethodsOne hundred SD rats were randomly divided into normal control group, model group, tripterygium glycosides group, paeonol high dose group and low dose group, each with 20 rats, half male and female. AA rat models were established by left toe after intradermal injection of complete Freund’s adjuvant in each group, and were given corresponding drug treatment. The foot swelling degree, arthritis index, serum inflammatory cytokines, rheumatoid factors (RF) and 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) levels, and serum oxidative stress related indexes levels were detected.ResultsAfter treatment, compared with model control group, the foot swelling degree of the rats on time d16,d20,d24 in each group were lower, tripterygium glycosides group,paeonol high dose grouppaeonol low dose group (P<0.05); the serum levels of malondialdehyde (MDA), NO of the rats in each group were lower, tripterygium glycosides group,paeonol high dose grouppaeonol low dose group (P<0.05).ConclusionThe paeonol can effectively reduce the serum levels of 5-HTP and IL-1,IL-6, improve the serum level of IL-2, exert anti-inflammatory and analgesic effects, can inhibit the oxidative stress reaction at the same time, and the effect was dose dependent.

adjuvant arthritis rat model; paeonol; arthritis index; 5- hydroxytryptophan; interleukin family

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.007

黑龍江省衛生廳科研課題(2013250)

石磊，男，碩士，主任醫師，研究方向；脊柱關節外科，E-mail：shileivip126@126.com；周成福，通信作者，本科，主任醫師，研究方向：關節外科，E-mail：zhouchengfu_dr@126.com。

R684.3；R285.5

A