臍血干細胞誘導分化為多巴胺能神經元對帕金森病大鼠的治療研究※

馬國祥黃麗霞劉 剛連勇軍楊振漢聶 劼

臍血干細胞誘導分化為多巴胺能神經元對帕金森病大鼠的治療研究※

馬國祥1黃麗霞1劉 剛2連勇軍3楊振漢1聶 劼1

目的 探究臍血干細胞誘導分化為多巴胺能神經元對大鼠的行為學測試在細胞移植治療帕金森病（PD）的研究分析。方法 選取醫院動物中心提供的大鼠，構建PD大鼠模型后，選取17只移植了臍血干細胞誘導的多巴胺能神經元大鼠作為研究組，同時選取17只注射0.9%氯化鈉注射液的大鼠作為對照組。①對比兩組大鼠在移植前1 d與細胞移植后的1 d、3 d、1周、2周、1個月、3個月和6個月時進行腹腔內阿樸嗎啡注射后旋轉數；②在進行細胞移植后的1 d、3 d、1周、2周、1個月、3個月和6個月時，檢測多巴胺的代謝產物如DOPAC和HVA，以了解紋狀體和黑質多巴胺的代謝情況；③將人臍血源性的干細胞注入大鼠腋區皮下和腦內觀察其體內成瘤能力。結果 ①研究組大鼠在移植前與移植后旋轉圈數明顯減少，而且隨著時間的推移有下降趨勢；對照組大鼠移植前后并無明顯減少現象，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；②主要檢測DOPAC和HVA，測試代謝結果較穩定；③研究組PD大鼠移植由臍血干細胞誘導分化后的多巴胺能神經元后，無形成畸形胎瘤的風險，安全性較高。結論 本研究成功地找到了廉價高效的臍血干細胞誘導分化為多巴胺能神經元的方法，并使PD大鼠癥狀減輕，PD大鼠行為明顯得到改善，說明誘導分化的多巴胺能神經元具有初步的臨床效果，具有進一步推廣的意義。

帕金森病；臍血干細胞；誘導分化；多巴胺能神經元

帕金森病（parkinson’s disease，PD）是中老年人常見的中樞神經系統變性疾病，病變累及多個系統，以黑質多巴胺（dopamine，DA）能系統變性為主。臨床分為內科和外科治療。內科以口服DA前體藥物左旋多巴為主，但這種藥物起初有效，長期服藥會出現療效下降，易引起一系列運動障礙等并發癥。普通的外科治療以改善蒼白球和丘腦毀損為主要方法，深部電刺激治療PD具有較好療效，特別是對丘腦底核的刺激要優于對蒼白球的刺激，但其遠期效果不確切，且費用昂貴［1］。人們已嘗試過自體腎上腺髓質、畸胎瘤神經元、胚胎多巴胺能神經元等，盡管取得了一定療效，但亦存在著各種問題。如患者或動物腎上腺髓質細胞、畸胎瘤神經元移植的結果表明療效差，病理檢查發現移植區幾乎沒有存活［2-3］。盡管胎腦DA能神經元移植顯示了短期內對PD癥狀的改善是肯定的，但其后研究也涉及許多問題，如胎齡的限制，胎齡只有在6～8周時效果最好，超過10周，胚胎細胞移植則較難存活，同時由于需要大量的胚胎供體，治療1例PD患者需要6～10個胎兒腦，而胚胎來源較少，以及倫理學上的問題等限制了此類治療在臨床上的進一步推廣應用［4］。因此，近幾年來研究的熱點逐漸集中于干細胞方面。研究表明，骨髓間充質干細胞（marrow stroma stem cell）具有分化為神經元和神經膠質細胞的能力。但是，骨髓源細胞有較高的病毒感染危險，且隨著年齡的增長其細胞數量和增殖、分化能力也顯著下降，較難滿足臨床需求［5-6］。因此，尋找新的細胞來源已成為神經系統疾病治療中的熱點。

臍血是胎兒出生時臍帶內及胎盤近胎兒側血管內血液，是胎兒血液循環的一部分。其所含的臍血干細胞是一種具有分化潛能的原始細胞，具備自我更新和增殖能力，并能在特定因素的影響或誘導下，向各種細胞或組織分化。研究表明，臍血干細胞含量豐富，占有核細胞的0.98%，是造血、內皮、間充質和神經等多種干細胞的來源［7-8］。本研究嘗試將臍血干細胞作為誘導分化多巴胺能神經元，對治療PD大鼠進行觀察研究，并檢測其分布、增殖、代謝以及其安全性，現將研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院動物中心提供的 SD雄性大鼠（重190～200 g），對健康雄鼠進行腹腔10%水合氯醛溶液注射，使其麻醉后剃去腦部毛發并固定于定位臺，進行消毒處理后切開腦部皮膚，使其露出顱骨，記錄前囟坐標，根據大鼠腦立體定位圖譜［9］，選取前腦內側束與右側黑質致密部各一點，使用電鉆鉆開顱骨，止血后用10 μl的微量注射器抽取配制好的六羥多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）溶液（加入0.9%氯化鈉注射液后濃度調制為2 μg/ul），每點注射4 μl，共8 μl。以每分鐘1 μl的速度緩慢注射溶液，留針約8 min后，再以每分鐘1 mm的速度緩慢退針。腦部切口用青霉素少量撒勻并縫合。1周時間內，進行傷口酒精消毒以及腹腔青霉素注射。大鼠手術恢復約1周后，用調制好的APO溶液進行腹腔注射，注射后分個體置于觀察籠內，并拴住老鼠胸部，5 min后開始計算旋轉圈數。以向左旋轉360° 為1圈，記錄30 min。30 min內如旋轉圈數大于180圈（即每分鐘6圈），則視為成功轉為PD大鼠。連續測試4周，每周測試1次，從中選取34只合格的PD大鼠，10只移植了臍血干細胞誘導的多巴胺能神經元PD大鼠，測試旋轉圈數用，另外7只移植了臍血干細胞誘導分化的多巴胺能神經元PD大鼠，作為移植后1 d、3 d、1周、2周、1個月、3個月和6個月后免疫化染色觀察用，以上17只大鼠作為研究組；同時選取17只注射0.9%氯化鈉注射液的PD大鼠作為對照組。另外選取5只PD大鼠在其腋區皮下和腦內注射臍血干細胞，用以檢測其體內成瘤能力。

對研究組與對照組大鼠進行手術移植，參考注射6-OHDA的方法，對研究組進行有熒光標記（熒光示蹤劑CFDA SE）的人臍血干細胞源性多巴胺能神經元立體定向移植（細胞數為 1×105/μl，每只動物注射10 μl），同時對對照組大鼠進行同量普通0.9%氯化鈉注射液的注射。

在移植后1 d、3 d、1周、2周、1個月、3個月和6個月時，選取研究組、對照組、移植前的PD大鼠、健康雄性大鼠各1只，用冷0.9%氯化鈉注射液灌注大鼠，取出完整腦組織，浸于福爾馬林溶液3 d后，取出大腦并分離紋狀體和黑質，采用蘇木精-伊紅（HE）染色切片進行顯微鏡觀察。并從研究組PD大鼠體內取得血液制作血漿樣本，同腦組織通過高效液相色譜法（HPLC）進行多巴胺代謝物的檢測。

1.2 檢測方法 ①在 PD大鼠進行細胞移植后，參考PD大鼠建模方法對兩組進行1 d、3天、1周、2周、1個月、3個月和6個月的旋轉圈數記錄，記錄時間為30 min。②使用HPLC檢測多巴胺的代謝產物如二羥苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA），以了解紋狀體和黑質多巴胺的代謝情況。③將人臍血源性的干細胞注入大鼠腋區皮下和腦內，觀察其體內成瘤能力。

1.3 統計學分析 選擇SPSS 18.0統計軟件進行數據統計，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 旋轉圈數比較 健康SD雄鼠未注射6-OHDA時，不會發生異常轉圈，經測試大鼠左右旋轉圈數相差無幾（30 min內15～20圈），注射6-OHDA后的PD大鼠，在腹腔注射阿樸嗎啡溶液后，則會發生異常旋轉，會向左側首尾相接的旋轉 360°，旋轉圈數相應增多。經統計，實驗前的研究組PD大鼠30 min內平均旋轉次數約285圈，對照組30 min內平均旋轉次數約 290圈，實驗前兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

在PD大鼠進行細胞移植后，對兩組進行1 d、3 d、1周、2周、1個月、3個月和6個月的旋轉圈數記錄（30 min），研究組PD大鼠每次測試的旋轉圈數明顯低于對照組，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 研究組與對照組PD大鼠每次測試旋轉行為的比較（圈/30 min，±s）

表1 研究組與對照組PD大鼠每次測試旋轉行為的比較（圈/30 min，±s）

組別 　只數 　1 d 　3 d 　1周 　2周對照組 　10 　278±41 　295±35 　289±43　312±37研究組 　10 　230±32 　242±28 　238±37　227±41組別 　　只數 　1個月 　3個月 　6個月對照組 　10 　308±29 　297±39 　332±27研究組 　10 　223±39 　219±37 　208±29

2.2 多巴胺代謝物 在 PD大鼠進行細胞移植后，在研究組選取進行1 d、3 d、1周、2周、1個月、3個月和6個月后的1只大鼠進行腦組織及血漿的HPLC檢測。檢測多巴胺的代謝物，主要檢測DOPAC 和HVA，以了解紋狀體和黑質多巴胺的代謝情況，測試代謝結果較穩定。見表2。

表2 研究組10只PD大鼠DOPAC與HVA的代謝結果（ng/ml）

2.3 安全性 選取5只PD大鼠，在其腋區皮下與腦內注入人臍血干細胞，通過顯微觀察檢測，其體內成瘤效果較好，無畸形肌瘤形成，證明人臍血源性干細胞移植效果安全。

3 討論

PD的治療目前多以神經細胞移植的方法常見，但是由于細胞的種類、移植方法及檢測方法等限制，大多數研究得不到準確有效的結論。但是，隨著近些年來醫學水平的不斷發展，方法與技術的不斷進步，移植細胞不僅能在宿主體內存活，并能與其腦內神經元建立突觸聯系［10］。

本研究采取人臍血干細胞移植技術對 PD大鼠進行移植實驗。在實驗過程中，發現有兩個主要問題可能會影響實驗的結果：一是對PD大鼠進行血液提取時，進行了麻醉狀態取血漿與清醒狀態取血漿的對比，發現在清醒狀態下對PD大鼠進行取樣，可刺激PD大鼠，導致遞質釋放較多，影響實驗結果，所以最終采取麻醉取樣。二是對取樣后的樣品進行即時處理、放置1 h處理、放置2 h處理對較，發現即時處理的樣品實驗效果更準，而放置1 h處理與放置2 h處理的遞質降解分別為75%和60%，這可能因為光或熱的影響［11］。

從實驗結果來看，研究組PD大鼠體內分泌多巴胺能神經元，能抑制或減輕其異常旋轉行為，從兩組的測試結果來看，研究組PD大鼠的旋轉圈數明顯少于對照組，并且圈數隨時間推移有下降的趨勢。另外，通過熒光顯微鏡等的觀察，發現移植后的研究組PD大鼠其體內的熒光跟蹤在1 d、3 d、1周、2周、1個月、3個月和6個月時，熒光胞體數量增殖增多，說明隨著時間的推移，胞體數量分裂穩定并增多；并且檢測移植后的大鼠并無畸形肌瘤的存在，說明人臍血干細胞源性移植的安全性較高。

其他如神經干細胞、骨髓間充質干細胞、胚胎干細胞等移植方法對PD均具有一定的效果，比如在柯春龍等［12］研究神經干細胞誘導分化多巴胺能神經元治療PD大鼠中提出，在移植20 d后PD大鼠旋轉行為明顯下降，但是在40 d與60 d相差無幾，說明效果一般且無長期增長效果。而在宋天然和陳貴安［13］研究胚胎干細胞（ESC）誘導分化多巴胺能治療PD大鼠的實驗顯示，ESC具有一定的可能性分化為多巴胺能神經元，但是無論是移植神經前體細胞或者是直接移植TH陽性細胞，最后TH陽性細胞存活率都很低。這些移植技術均存在不可逃避的實踐弊端與道德倫理問題，所以均未能滿足臨床治療要求。

在結合大多數移植技術的優勢與弊端并從中開辟出有效的移植方式，本研究采取人臍血干細胞，并通過誘導分化得到多巴胺能神經元，從而有效改善PD大鼠的異常行為。相對于神經干細胞、骨髓間充質干細胞、胚胎干細胞等移植方法，試驗結果穩定，安全有效，更符合臨床應用的價值。

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R742.5

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.08.029

1深圳市福永人民醫院，廣東深圳 518103

2中山大學第三附屬醫院，廣東廣州 510630

3深圳市第一人民醫院，廣東深圳 518020

※深圳市級科研立項課題（人臍血干細胞誘導分化為多巴胺能神經元及其應用研究，編號：201303136）