人乙肝相關肝硬化和肝卵圓細胞分子調控機制差異性研究

肖國勝 潘海波 黃春霞

人乙肝相關肝硬化和肝卵圓細胞分子調控機制差異性研究

肖國勝 潘海波 黃春霞

目的 探討人乙肝相關肝硬化和肝卵圓細胞（HPC）分子調控機制差異性。方法 選取2012年1月至2014年12月深圳市龍崗區第二人民醫院收治的78例乙型肝炎相關肝硬化患者，肝硬化程度：輕度20例，中度33例，重度25例；肝癌患者67例。另外，選擇同期于該院體檢的15例健康體檢者作為對照組。利用實時熒光定量PCR法篩選和檢測HPC細胞中靶基因表達水平；采用免疫組化法檢測乙型肝炎相關肝硬化患者的HPC細胞數目變化情況及相關蛋白表達水平。結果 通過檢測發現，表征腫瘤發生的靶基因，如皮細胞粘附分子（EpCAM）、重組人S100鈣結合蛋白A4（S100A4）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、波形蛋白（Vimentin）及轉化生長因子-β（TGF-β1）隨著乙型肝炎相關肝硬化疾病的嚴重程度增加而表達增加；免疫組化結果顯示，HPC陽性細胞數目隨著乙型肝炎相關肝硬化疾病嚴重程度增加而增加；同時表征潛在腫瘤化的標記蛋白，如NCAM、S100A4以及MMP-2在重度肝硬化患者中也顯著增加。結論 本研究證明乙型肝炎相關肝硬化的HPC具有轉變為肝癌腫瘤干細胞的潛在風險，為乙型肝炎相關肝硬化和肝癌的治療提供了新的潛在藥物靶點和治療策略。

乙型肝炎；肝硬化；肝卵圓細胞；肝癌

【Abstract】Objective To investigate the molecular regulation mechanism of hepatitis B related cirrhosis and hepatic oval cell （HPC） in human.Methods From January 2012 to December 2014，78 patients with hepatitis B related cirrhosis were selected from the second people's Hospital of Longgang District，Shenzhen City，the degree of cirrhosis of the liver: 20 cases of mild，moderate 33 cases，severe 25 cases；67 cases of liver cancer patients.In addition，15 cases of healthy physical examination in our hospital were selected as control group.To screen and detect the expression level of target genes in HPC cells by real-time fluorescent quantitative PCR，and to detect the change of HPC cell number and the relative protein expression level of HBV related cirrhosis patients by immunohistochemistry. Results Through testing found that tumor characterization of target genes，such as skin cell adhesion molecule （EpCAM），recombinant human S100 calcium binding protein A4 （S100A4），matrix metalloproteinase 2（MMP-2），vimentin and transforming growth factor beta 1（TGF-1） with hepatitis B related cirrhosis disease severity increasedwith increased expression；immunohistochemistry results showed，number of positive cells in the HPC increases with an increase in the severity of hepatitis B related cirrhosis disease；at the same time characterization of potential tumor marker protein，such as NCAM，S100A4 and MMP-2 in severe patients with liver cirrhosis was also increased significantly.Conclusions Our work identified that HPC has the potential to turn into cancer stem cells in patients with liver cirrhosis.These findings may provide new targets and strategies for the treatment of liver diseases.

【Key words】Hepatitis B；Cirrhosis；HPC；Carcinoma

肝卵圓細胞（hepatic progenitor cell，HPC）是唯一一 種在成體肝臟內發現的干細胞，其具有雙向分化能力，在慢性肝病的修復過程中發揮著重要作用［1］。但是，肝癌組織中的腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）也可同時表達HPC標記物［2］。目前，關于HPC在肝癌發生和發展過程中的作用及調控機制仍不甚清楚。本研究就人乙型肝炎相關肝硬化與HPC分子調控機制差異性進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年12月我院收治的 78例乙型肝炎相關肝硬化患者，其中男42例，年齡（46±10）歲，女36例，年齡（44± 12）歲；肝硬化程度：輕度20例，中度33例，重度25例。肝癌患者67例，其中男34例，年齡（69± 5）歲；女33例，年齡（67±7）歲。另外，選擇同期于我院體檢的15例健康體檢者作為對照組，其中男8例，年齡（39±11）歲；女7例，年齡（37± 13）歲。以上樣本的收集均獲得患者同意及深圳市龍崗區第二人民醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與試劑 免疫組化所需封閉山羊血清，山羊抗鼠、兔紅/綠熒光二抗，含DAPI抗淬滅封片劑等購自Invitrogen公司；熒光實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）所需的Trizol試劑購自Invitrogen，cDNA反轉錄試劑盒Top Green qPCR SuperMix購自Thermo Scientific公司；其余試劑均為分析純。

1.2.2 實時熒光定量 PCR 本試驗采用新鮮人肝臟組織，通過分離樣本中HPC細胞，檢測其靶基因表達水平。首先，收集所有研究對象的肝臟組織樣本，采用膠原酶Ⅳ消化（37 ℃，無菌環境下），制成單細胞懸液；磁珠抗體Ov6與單細胞懸液孵育；激光流式細胞計磁分選出Ov6+細胞，剩余部分為其他細胞，并檢測細胞純度及細胞存活率。隨后得到的HPC細胞，利用Trizol提取總核糖核酸（RNA）。將管底RNA沉淀晾干，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解，瓊脂糖電泳檢測RNA質量。隨后將得到的總RNA進行反轉錄，得到總cDNA進行熒光實時定量PCR檢測。采用Top Green qPCR SuperMix反應體系，包括Top Green qPCR SuperMix、上游引物、下游引物、cDNA模板和RNase-free water。反應程序為：95 ℃ 30 s，1 cycles；95 ℃ 5s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles；試驗設置3個平行復孔，檢測結果取平均值。

1.2.3 免疫組化 采用新鮮人肝臟組織進行石蠟切片和免疫組化，檢測乙型肝炎相關肝硬化患者的HPC細胞數目變化情況及相關蛋白表達水平。具體包括：①新鮮組織石蠟切片脫蠟至水；②抗原修復；③磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗；④滴加相應一抗；⑤PBS清洗；⑥滴加相應二抗；⑦PBS清洗；⑧抗熒光淬滅封片劑（DAPI）進行封片；⑨鏡下觀察，拍照。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR結果分析 通過檢測發現，表征腫瘤發生的靶基因，如皮細胞粘附分子（EpCAM）、重組人S100鈣結合蛋白A4（S100A4）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、波形蛋白（Vimentin）及轉化生長因子-β（TGF-β1）隨著乙型肝炎相關肝硬化疾病的嚴重程度增加而表達增加，見圖1。

2.2 免疫組化結果分析 免疫組化結果顯示，HPC陽性細胞數目隨著乙型肝炎相關肝硬化疾病嚴重程度增加而增加；同時表征潛在腫瘤化的標記蛋白，如NCAM、S100A4以及MMP-2在重度肝硬化患者中也顯著增加，見圖2。

3 討論

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是持續性肝損傷的共有病理改變，以細胞外基質（ECM）在肝內過量沉積為病理特征；如果損傷因素長期維持，其可發展成為肝硬化，甚至肝癌［3］。目前醫學界缺乏應對肝癌的有效治療手段，雖然肝移植能顯著改善患者生存率，卻受到供體稀缺、受體必須終身服用免疫抑制劑和對于施術者技術要求苛刻等諸多因素限制。

近年來研究發現，30%～50%肝癌細胞中的CSC可表達HPC標記物（如CK7和CK9），其中部分細胞還具有介于HPC和成熟肝細胞兩者之間的細胞形態［4］。同時，肝癌的癌前病變（約55%）中也被證實存在HPC或者中間型細胞［5］。進一步研究發現，當HPC內在信號通路調控發生紊亂時，HPC具有明確的惡性轉化傾向。同時，Bmi1和Wnt/β-actenin信號通路的上調也能使HPC的自我更新能力異常增強，抑癌基因 DMBT1的低表達甚至缺失表達可能會增加HPC惡變的風險。

圖1 相關基因mRNA表達水平

圖2 HPC陽性細胞數目及相關蛋白表達水平

本研究結果顯示，乙型肝炎相關肝硬化患者的HPC較正常人HPC重要調控基因發生了顯著表達改變，如 EpCAM、S100A4、MMP-2、Vimentin和TGF-β1。而這些表達顯著上調的基因均與腫瘤發生密切相關的基因。EpCAM編碼是一個跨膜糖蛋白，在細胞信號轉導、遷移、增殖和分化過程中發揮著重要作用。同時EpCAM還具有原癌基因活性，能夠上調原癌基因（c-myc）、e-fabp以及細胞周期蛋白（Cyclins）的表達。有研究曾指出，S100A4過度表達會引起腫瘤生長增加和血管生成［6］，而抑制S100A4的表達可用于控制部分腫瘤的惡化。此外，MMP-2、Vimentin及TGF-β1均被認為在許多腫瘤的發展進程中起著重要作用，并且可作為潛在腫瘤發生的重要標記物。在本研究中，上述基因均表達上調，提示乙型肝炎相關肝硬化患者的HPC具有轉變為CSC的潛在風險。因此，針對上述HPC的腫瘤表達基因檢測和抑制，將為肝癌的預防和治療提供新的思路和潛在靶點。另一方面，通過新鮮標本的收集、石蠟切片及免疫檢測，發現在乙型肝炎相關肝硬化患者中，HPC數量隨著肝硬化疾病嚴重程度增加而增加，兩者成正相關。本研究將為HPC作為臨床治療新靶點奠定堅實的理論基礎，并篩選得到了HPC中與乙型肝炎相關肝硬化和肝癌直接相關的靶標基因，為乙型肝炎相關肝硬化和肝癌的治療提供了新的藥物靶點和治療策略。

［1］ 陳楨坤.miR-21在大鼠肝卵圓細胞活化和增殖過程中作用研究［J］.溫州醫科大學，2014，22（11）:854-859.

［2］ 廖凱，王月飛，盧樂樂，等.乙型肝炎病毒X蛋白誘導肝卵圓細胞惡性轉化［J］.第三軍醫大學學報，2014，36（10）:992-995.

［3］ 王勝春，王洋，胡詠武，等.肝卵圓細胞對肝纖維化大鼠細胞外信號調節蛋白和絲裂原激活蛋白激酶的影響［J］.中華普通外科雜志，2011，26（1）:52-57.

［4］ 方方，劉前進，岳學強，等.CK19和 PCNA在肝纖維化大鼠部分肝切除后再生肝中的表達［J］.中國臨床解剖學雜志，2012，30（5）: 552-555.

［5］ Noemi K.M.Van Hul，J Abarca-Quinones，C Sempoux，et al. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury［J］.Hepatology，2009，49（5）:1625-1635.

［6］ NV Soshnikova，YP Simonov，AV Brechalov，et al.The level of the Phf10 protein，a PBAF chromatin-remodeling complex subunit，correlates with the Mts1/S100A4 expression in human cancer cell lines［J］.Doklady Biochemistry&Biophysics，2016，467（1）:162-164.

Alternations of Hepatic Progenitor Cells in Pathological Development of Hepatitis B and Liver Cirrhosis

Xiao Guosheng Pan Haibo Huang chunxia

R512.62

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.08.036

深圳市龍崗區第二人民醫院，廣東深圳 518112

肖國勝，碩士學位，主治醫師。研究方向：普外科