抑制miR-101表達對結直腸癌SW480細胞增殖、周期及凋亡的影響

劉燕，陸滟霞，周敏，鄭林，李學農

(1 川北醫學院病理學系，四川南充637000；2 川北醫學院附屬醫院;3 南方醫科大學病理學系)

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抑制miR-101表達對結直腸癌SW480細胞增殖、周期及凋亡的影響

劉燕1,2，陸滟霞3，周敏3，鄭林3，李學農3

(1 川北醫學院病理學系，四川南充637000；2 川北醫學院附屬醫院;3 南方醫科大學病理學系)

目的觀察抑制miR-101表達對結直腸癌細胞SW480增殖、細胞周期及凋亡的影響。方法取SW480細胞分為A、B、C組，A組轉染miR-101抑制物，抑制miR-101表達，B組轉染無義序列miRNA，C組為不做任何處理的空白組。轉染48 h時觀察各組細胞增殖、周期及凋亡情況。結果隨時間增加，各組細胞細胞增殖的OD值均升高(P均<0.05)；培養第2、3、4、5天A組細胞增殖的OD值均高于B、C組(P均<0.05)。轉染48 h時A組S期細胞所占比例明顯高于B、C組，G1與G2/M期細胞所占比例明顯低于B、C組(P均<0.05)。A、B、C組細胞凋亡率分別為3.29%±0.09%、4.57%±0.21%、2.00%±0.11%( F=230.762;P<0.05)。結論抑制miR-101表達可促進SW480細胞增殖、阻滯細胞周期于S期、抑制細胞凋亡。干擾miR-101后能夠促進結直腸癌細胞SW480的增殖，細胞S期周期阻滯及抑制細胞凋亡。

微小RNA;miR-101；結腸腫瘤；直腸腫瘤；細胞增殖；細胞凋亡；細胞周期

miR-101是微小RNA(miRNA)家族中的一員，在腫瘤的發生、轉移及侵襲等過程中發揮重要作用[1,2]。miR-101抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲[3,4]。目前關于miR-101對結直腸癌細胞的增殖、凋亡影響的相關研究較少。本課題組前期研究發現，miR-101在低轉移的結直腸癌細胞株SW480中表達水平較高，而在高轉移細胞株SW620中表達水平較低，并能靶向調控RACl的表達[5]。2013年8月～2014年6月，我們觀察了miR-101SW480細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響，現將結果報告如下。

1　材料與方法

1.1細胞、材料、試劑及儀器結直腸癌細胞株SW480由本實驗室保存，置于含5%胎牛血清的RPMI1640完全培養基，37 ℃、5%CO2細胞培養箱內培養。胰酶購自于杭州吉諾公司，細胞周期試劑盒、細胞凋亡試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2SW480細胞分組及miR-101抑制物轉染方法取適量對數生長期SW480細胞，分為A、B、C組，A組轉染miR-101抑制物，抑制miR-101表達，B組轉染無義序列miRNA，所有操作均嚴格按照使用說明書進行；C組為不做任何處理的空白組。轉染36 h時采用熒光定量PCR檢測各組miR-101，A組miR-101的相對表達量(0.546 1±0.028 7)低于B、C組(分別為0.816 7±0.0597 4、1.000±0)，差異具有統計學意義，說明轉染成功。

1.3各組細胞增殖情況觀察采用CCK-8法。取轉染48 h時各組細胞，消化后計數，接種于96孔板中，2 000/孔，每組3個復孔。待細胞貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8試劑后37 ℃孵育2 h，以blank對照孔進行調零，分別于第2、3、4、5天使用Glo MaxTM96 Microplate Luminometer發光檢測儀檢測各組OD值，以OD值表示該組細胞增殖能力的大小，OD值越大代表細胞增殖能力越強。實驗重復3次，取平均值。

1.4各組細胞周期觀察干預48 h時取對數生長期各組細胞，PBS清洗2次，加入胰酶消化，2 000 r/min離心5mim，第2 d于室溫下1 000 r/min離心5min，PBS清洗2次，然后加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min后，加入400 μL PI，混勻后4 ℃避光30 min。采用流式細胞儀觀察各組細胞周期，計算細胞周期G1、S、G2/M期所占比例。實驗重復3次，取平均值。

1.5各組細胞凋亡情況觀察干預48 h時取對數生長期各組細胞，PBS沖洗2次，2 000 r/min離心5min，收集(1～5)×105細胞，加入500 μL 1×Binding Buffer 懸浮細胞，加入1 μL AnneXinV-PE，輕輕混勻，4 ℃避光反應15 min，加入5 μL7AAD再次混勻，4℃避光孵育15min，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

2　結果

2.1各組細胞增殖情況比較不同培養時間A、B、C組細胞增殖的OD值比較見表1。隨時間增加，各組細胞細胞增殖的OD值均升高(P均<0.05)。分別培養第2、3、4、5天，A組細胞增殖OD值高于B、C組(P均<0.05)。

表1　不同培養時間各組細胞增殖的OD值±s)

2.2各組細胞周期比較分析轉染48 h時各組細胞周期比較見表2。轉染48 h時A組S期細胞所占比例明顯高于B、C組，G1與G2/M期細胞所占比例明顯低于B、C組(P均<0.05)。

表2　干預48 h時各組細胞周期分布

2.3各組細胞凋亡率比較A、B、C組細胞凋亡率分別為3.29%±0.09%、4.57%±0.21%、2.00%±0.11%，組間兩兩比較，P均<0.05。

3　討論

miRNAs是一類類似于癌或抑癌基因作用的非編碼小分子RNA家族[4]。研究發現，miR-101在乳腺癌[1]、肺癌、肝癌、前列腺癌、垂體腺瘤、胰腺癌、骨肉瘤[2，4]、膽囊癌[3]等實體腫瘤中表達下調，可能參與腫瘤的發生、轉移、侵襲等過程，起著抑制腫瘤發生的作用[3]。在肺癌細胞中，miR-101通過靶向調控COX-2的表達可抑制肺癌細胞的增殖與遷移[6,7]。Lv等[8,9]研究表明，在胃癌細胞及其組織中miR-101的表達均下調，并且與腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關。在結直腸癌中，miR-101可在轉錄后水平調控EP4受體的表達[10]。在結直腸癌中miR-101可調控EP4受體、PTGS2及ASPN的表達[11]。miR-101可靶向調控下調EZH2抑制食管癌細胞的增殖、遷移能力[12]；CXCR7而抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲能力[13]；靶向作用于Rac1抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的生長[14]，本課題組前期研究中也發現而miR-101能靶向調控結直腸癌細胞RACl表達[9]。表明miR-101可能通過靶向調控RAC1調節結直腸癌的生物學行為，參與結直腸癌的發生進展過程。

本研究發現，A組細胞增殖的OD值均高于B、C組，這表明miR-101可能抑制結直腸癌細胞的增殖。Strillaccia 等[11]研究發現，在結腸癌患者的癌組織標本中miR-101表達明顯低于其癌旁組織，高表達 miR-101可抑制結腸癌細胞的遠處轉移。與本研究結果一致。

對于已經發生轉移的結直腸癌，放射治療是重要的治療方式方式，其效果如何，與腫瘤細胞周期分布密不可分。通常認為G2/M期對放療最為敏感，G1次之，S期最不敏感。細胞發生G2/M 期阻滯時將無法完成其DNA 損傷修復,從而引起G2/M 期阻滯延長,細胞的增殖能力下降,導致細胞增殖死亡[15,16]。miR-101是否能增強結直腸癌患者對放療的敏感性，尚有待于進一步研究[17]。本研究發現，B組細胞凋亡率明顯高于A、C組，A組細胞凋亡率明顯高于C組，差異均具有統計學意義，表明miR-101可能促進結直腸癌細胞的凋亡，且轉染過程本身可能導致細胞著損傷，促進細胞凋亡。

綜上所述，抑制miR-101表達可促進SW480細胞增殖、阻滯細胞周期于S期、抑制細胞凋亡。干擾miR-101后能夠促進結直腸癌細胞SW480的增殖，細胞S期周期阻滯及抑制細胞凋亡。但其具體機制尚有待于今后進一步研究。

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國家自然科學基金資助項目(81272758，81302158)。

李學農(E-mail: leexue0@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.012

R782

A

1002-266X(2016)27-0038-03

2016-02-17)