五味子多糖對人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞活力的影響及其機(jī)制

溫娜，金宏，齊玲，唐澤波

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林132013)

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五味子多糖對人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞活力的影響及其機(jī)制

溫娜，金宏，齊玲，唐澤波

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林132013)

目的觀察五味子多糖(CPSC)對人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞活力的影響，并探討其可能作用機(jī)制。方法取適量對數(shù)生長期人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，分為A、B、C組和對照組，A、B、C組分別加入終濃度為200、400、800 μg/mL的 CPSP培養(yǎng)，對照組加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時觀察各組細(xì)胞活力；培養(yǎng)48 h時取各組培養(yǎng)液上清，檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)。結(jié)果培養(yǎng)24、48、72 h時，A組細(xì)胞存活率分別為1.17±0.04、1.09±0.05、1.39±0.05，B組分別為1.01±0.03、1.01±0.03、1.21±0.02，C組分別為0.90±0.02、0.76±0.02、0.98±0.03，對照組分別為1.28±0.03、1.16±0.03、1.45±0.01；培養(yǎng)72 h時，B組細(xì)胞存活率與對照組相比，P<0.05；培養(yǎng)24、48、72 h時，C組細(xì)胞存活率與對照組相比，P均<0.05。培養(yǎng)48 h時A、B、C組及對照組培養(yǎng)液上清Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量分別為0.79±0.02、0.96±0.01、1.13±0.01、0.78±0.01，B、C組與對照組相比，P均<0.05。結(jié)論高濃度CPSC可抑制U87細(xì)胞的活力，其機(jī)制可能是與CPSC促進(jìn)細(xì)胞Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

五味子多糖；膠質(zhì)瘤；腦膠質(zhì)瘤；多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；細(xì)胞活力；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

腦膠質(zhì)瘤是最為常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均居成年患者顱內(nèi)惡性腫瘤的首位[1]。細(xì)胞凋亡在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)是常用的臨床檢測指標(biāo)。腦膠質(zhì)瘤U87是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，是惡性程度最高的星形細(xì)胞瘤。目前臨床尚無有效治療方法，手術(shù)切除和放、化療是其主要治療方法，但患者預(yù)后較差[2]。尋找高效低毒的抗腫瘤藥物是目前的研究熱點(diǎn)[3]。五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，五味子多糖(CPSC)和木脂素是其主要活性成分[4，5]。中醫(yī)認(rèn)為其具有斂肺止咳[6]、滋補(bǔ)澀精[7，8]、止瀉止汗[9，10]之功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CPSC可明顯抑制體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[11]。2015年1～12月，我們觀察了CPSC對U87細(xì)胞活力的影響，并探討其可能作用機(jī)制，旨在為腦膠質(zhì)瘤的治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、材料及試劑U87細(xì)胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部提供。CPSC由北華大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心饋贈；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Sigma公司)；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone公司)；小牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)；二甲基亞砜(DMSO，Thermo公司)；Caspase-3抗體(中杉公司)。

1.2U87細(xì)胞分組及CPSP給藥方法取適量對數(shù)生長期U87細(xì)胞懸于培養(yǎng)液中，按細(xì)胞濃度8×105/mL接種于96孔板，每孔100 μL。將細(xì)胞分為A、B、C組和對照組，每組5個復(fù)孔。A、B、C組分別加入終濃度為200、400、800 μg/mL CPSP，對照組加入等體積5%的RPMI1640培養(yǎng)液，置入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

1.3各組細(xì)胞活力檢測采用MTT法。分別取CPSP作用24、48、72 h時各組細(xì)胞，檢測CPSC對U87細(xì)胞生長的作用，取對數(shù)生長期各組細(xì)胞去上清，加入20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h,150 μL DMSO振蕩20 min，使其結(jié)晶溶解，10 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀測定各組490 nm波長處的吸光度(A490)值，用不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)。以細(xì)胞存活率代表細(xì)胞的活力。

1.4各組培養(yǎng)液上清Caspase-3蛋白檢測采用ELISA法。取CPSC作用48 h時各組細(xì)胞，按細(xì)胞濃度1×105/mL接種于24孔板中，每孔100 μL,每組5個復(fù)孔。取培養(yǎng)液上清包被96孔酶標(biāo)板4 ℃過液，封閉后加入Caspase-3抗體(1∶500稀釋)4 ℃過夜。次日二抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育2 h，DAB顯色。采用自動酶標(biāo)儀測定各組在492 nm處的吸光度A值，計(jì)算Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞存活率比較不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞存活率比較見表1。

表1　不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞存活率比較±s)

注：與對照組比較,*P<0.05，#P<0.01。

2.2各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清Caspase-3蛋白水平比較培養(yǎng)48 h時A、B、C組及對照組培養(yǎng)上清Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量分別為0.79±0.02、0.96±0.01、1.13±0.01、0.78±0.01，B、C組與對照組相比，P均<0.05。

3　討論

五味子是我國著名的滋補(bǔ)性傳統(tǒng)中藥[12]，其提取物中含有多種化學(xué)成分，包括多糖、木脂素、揮發(fā)油、脂肪油、有機(jī)酸、氨基酸、色素等[13]。其中CPSC藥理作用較為廣泛，具有保肝[14]、抗氧化[15]、抗變態(tài)[16]、增強(qiáng)免疫力[17]、降脂[18]、降糖[19]、鎮(zhèn)痛[20]、抗腫瘤[6～10]等多方面的藥理作用。一方面CPSC可通過促進(jìn)凋亡、氧化應(yīng)激、清除氧自由基等多種方式抑制腫瘤生長;另一方面其可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力來增強(qiáng)抗腫瘤作用[4]。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，CPSC的抗腫瘤作用多與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。許娜等[7]研究發(fā)現(xiàn)CPSC能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，作用機(jī)制與凋亡的線粒體途徑有關(guān)。盧冠男等[8]研究表明，CPSC抑制lewis肺癌細(xì)胞的增殖的作用機(jī)制可能與調(diào)控Fas/FasL系統(tǒng)有關(guān)。韓斌等[9]研究表明，CPSC對乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的生長抑制作用與誘發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

腦膠質(zhì)瘤也叫膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤，是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，所以也叫神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤。大多數(shù)腫瘤起源于不同類型的神經(jīng)膠質(zhì)，但根據(jù)組織發(fā)生學(xué)來源及生物學(xué)特征類似，對發(fā)生于神經(jīng)外胚層的各種復(fù)雜腫瘤，一般都稱為腦膠質(zhì)瘤。就病理發(fā)生學(xué)而言，腦膠質(zhì)瘤是在內(nèi)部遺傳易感因素與外部環(huán)境致病因素相互作用所導(dǎo)致的。一方面，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)(DNA)及表觀遺傳物質(zhì)水平，發(fā)生了足以致癌的突變，以及突變的組合，這些突變使細(xì)胞進(jìn)入周期性有絲分裂、逃避凋亡、躲避細(xì)胞的生長接觸抑制、躲避免疫抑制等，使細(xì)胞獲得與持續(xù)增長相適應(yīng)的能量代謝異常、誘導(dǎo)腫瘤新生血管生長。另一方面，一些環(huán)境的致癌因素也可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生相關(guān)。有研究表明，電磁輻射，可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生相關(guān)。但是，目前并沒有證據(jù)表明，彼此間存在必然的因果關(guān)系。雖然大部分的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者都曾存在巨噬細(xì)胞病毒感染史，并且在絕大部分的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病理標(biāo)本中都發(fā)現(xiàn)存在巨噬細(xì)胞病毒感染，但兩者間是否存在因果關(guān)系，目前也尚不清楚。為了系統(tǒng)地了解膠質(zhì)瘤的分子病因?qū)W，美國在 2008年啟動了膠質(zhì)瘤的分子基因圖譜工程。通過對膠質(zhì)瘤的DNA進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)平均每個膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，有高達(dá)5個分子突變。其中，NF基因是最常見發(fā)生突變的抑癌基因；EGFR是最常見的原癌基因。這些分子突變，驅(qū)動各種信號通道的表達(dá)并構(gòu)成膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)。

U87細(xì)胞是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，是惡性程度最高的星形細(xì)胞瘤。具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高和治愈率低的特點(diǎn)，預(yù)后相對較差，病死率較高。因此，有必要研究對膠質(zhì)瘤治療有效的藥物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A、B組和對照組細(xì)胞活力間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但細(xì)胞的生長均呈下降趨勢。CPSP作用24、48、72 h時，C組細(xì)胞存活率均低于對照組；說明CPSC可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，猜測其可能作用機(jī)制為：①誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；②抑制瘤細(xì)胞的生長；③使腫瘤細(xì)胞壞死。國內(nèi)外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)腫瘤凋亡傳導(dǎo)的通路中，線粒體信號傳導(dǎo)通路一直處于極其重要的地位。線粒體凋亡通路在細(xì)胞凋亡過程中處于中心地位。Caspases是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，許多調(diào)控細(xì)胞凋亡的因素都通過Caspases酶系起作用，一旦被激活，即引起下游一系列的級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡不可避免。因此，Caspase-3被稱為“凋亡蛋白酶”，在凋亡過程中起著關(guān)鍵性作用。以往研究發(fā)現(xiàn)CPSC可明顯抑制體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)B、C組Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量均高于對照組，說明CPSC可以通過增加凋亡通路執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，高濃度CPSC可抑制U87細(xì)胞的活性，可能與其促進(jìn)Caspase-3表達(dá)有關(guān)。但其具體作用機(jī)制還有待深入研究。

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Effects of schisandra chinensis polysaccharide on cell activity of human brain glioma U87 cells

WEN Na,JIN Hong,QI Ling,TANG Zebo

(College of Basic Medical Sciences,Jinlin Medical University,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo observe the effects of schisandra chinensis polysaccharides(CPSC)on the cell activity of human brain glioma U87 cells,and to explore its possible mechanism.MethodsThe human glioma U87 cells in the logarithmic growth phase were divided into groups A,B,C and control group.The cells in the groups A,B and C were added with the final concentrations of 200,400 and 800 μg/mL of CPSP to culture.The control group was treated with the equal volume of cell culture fluid.The cell viability was observed at 24,48 and 72 h after culture.At 48 h,the cysteine aspartic acid proteinase 3(Caspase-3)in the nutrient solution supernatant was detected.ResultsAt 24,48 and 72 h,the cell survival rates of group A were respectively 1.17±0.04,1.09±0.05 and 1.39±0.05.The cell survival rates of group B were respectively 1.01±0.03,1.01±0.03 and 1.21±0.02.The cell survival rates of group C were respectively 0.90±0.02,0.76±0.02 and 0.98±0.03.The cell survival rates of the control group were respectively 1.28±0.03,1.16±0.03 and 1.45±0.01.At 72 h,the cell survival rate of group B was statistically significant as compared with that of the control group(P<0.05).Significant difference was found in the survival rate between group C and control group at 24,48 and 72 h(P<0.05).The relative expression of Caspase-3 protein in cultural supernatant of groups A,B,C and control group was respectively 0.79±0.02,0.96±0.01,1.13±0.01 and 0.78±0.01,and significant difference was found between the groups B,C and the control group(all P<0.05).ConclusionHigh concentration of CPSC can inhibit the viability of U87 cells,and its mechanism may be that cpsc promote the Caspase-3 expression.

schisandra chinensis polysaccharides;glioma;brain glioma;glioblastoma multiforme;cell viability;cysteine aspartate protease 3

吉林省科技廳資助項(xiàng)目(20140414049GH)；吉林省教育廳資助項(xiàng)目(2012329，2014365)。

溫娜(1981-)，女，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)槟X腫瘤的治療藥物。E-mail: 51176680qq@.com

簡介：唐澤波(1979-)，男，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)槟X腫瘤的治療藥物。E-mail: tzbking122981@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.002

R593.25

A

1002-266X(2016)27-0005-03

2016-04-29)