不同地區粘豆包酸面團中微生物多樣性分析

陶東婭，金銀旗（.臺州職業技術學院機電工程學院，浙江臺州38000；.臺州市光躍飲水設備有限公司，浙江臺州3800）

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不同地區粘豆包酸面團中微生物多樣性分析

陶東婭1，金銀旗2
（1.臺州職業技術學院機電工程學院，浙江臺州318000；2.臺州市光躍飲水設備有限公司，浙江臺州318020）

本研究以采集自黑龍江不同縣的粘豆包酸面團為研究對象，利用變性梯度凝膠電泳和基因測序技術對上述樣品中的細菌和真菌的多樣性進行揭示。結果表明：在4種樣品中細菌的多樣性高于真菌，并發現了7種不同的細菌菌種，4個不同的真菌菌種，其中以乳桿菌屬中的微生物最為豐富。通過不同地區樣品多樣性的比較發現：粘豆包酸面團中微生物的多樣性與收集地之間存在一定的聯系。

粘豆包酸面團；微生物多樣性；變形梯度凝膠電泳；基因測序

傳統粘豆包是利用自然環境中天然野菌種進行發酵后包裹紅豆餡蒸制而成的冷凍類傳統自然發酵食品，產品色澤亮黃、粘稠筋道、營養豐富，且礦物質等能在酸化過程中被充分的吸收利用［1-2］。在粘豆包的制作過程中，粘豆包酸面團的自然發酵是最重要的環節之一，同時正是因為要依靠天然發酵，所以粘豆包酸面團的風味和品質具有很強的地域特色［3-4］。

粘豆包酸面團的自然發酵主要是細菌和真菌的發酵，楊健等對黑龍江省肇州縣的粘豆包酸面團進行了細菌多樣性的研究，初步揭示了其細菌的多樣性［5］。Tingtao Chen等研究了不同原料和配比對粘豆包酸面團中微生物組成的影響，發現相比單一谷物的酸面團，混合配比的酸面團的微生物多樣性更為豐富，且主要的菌屬為乳酸菌和酵母菌［6］。本研究在上述研究的基礎上，采集了黑龍江省不同地區的粘豆包酸面團（大黃米面∶玉米面=3∶1，質量比），對其進行了細菌和真菌的多樣性分析，以期全面揭示黑龍江地區粘豆包酸面團微生物的組成結構，并闡述粘豆包酸面團微生物多樣性與地域之間的關系，為開發工業化的粘豆包發酵劑提供理論參考。

1　材料與儀器

1.1主要材料

1.1.1樣品來源

本試驗采用的粘豆包酸面團均采購自不同地區的農民家庭，這些地區分別為：黑龍江省牡丹江市東寧縣、黑龍江省哈爾濱市賓縣、黑龍江省雙鴨山市寶清縣和黑龍江省綏化市青岡縣，這些樣品的主要原料均為大黃米面和玉米面，比例均為3∶1（質量比），并分別編碼為樣品A、B、C和D。

1.1.2主要試劑

細菌全基因組DNA提取試劑盒、真菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix（含染料）、D2000，上述生物試劑均購買自北京天根生化科技有限公司；無水乙醇：山東紫翔化工銷售有限公司；瓊脂糖：南京生興生物；丙烯酰胺：濟南智恒致遠化工科技有限公司；雙丙烯酰胺：濟南智恒致遠化工科技有限公司；冰醋酸：保定市百運化工有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）：保定市百運化工有限公司；尿素：保定市百運化工有限公司；去離子甲酰胺：上海酶聯生物研究所；四甲基乙二胺（TEMED）：上海博谷生物；過硫酸銨：濟南世紀通達化工有限公司；硝酸銀：廣州市鑫鉑化工有限公司；甲醛：青州市恒興化工有限公司。

1.2試驗儀器

TCL16G離心機：上海姚氏儀器設備廠；PL203型電子分析天平：上海儀電科學儀器股份有限公司；水浴鍋：上海儀電科學儀器股份有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠；變性梯度凝膠（DGGE）電泳儀：美國Bio-Rad公司。

2　方法

2.1樣品DNA的提取

根據楊健等［5］的報道制備粘豆包酸面團的懸浮液，之后按照細菌DNA提取試劑盒和真菌提取試劑盒說明書提取樣品中細菌和真菌的DNA。

2.2DNA的PCR擴增

以樣品細菌的DNA為模板，引物采用細菌16S rRNA V3區引物BA338f-GC和UN518r，引物序列和擴增條件如費鵬等的報道［7］。以樣品真菌DNA為模板，引物采用真菌26S rRNA D1/D2區引物NL1-GC和LS2，引物序列和擴增條件如姚笛等的報道［8］。

2.3變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析

細菌DNA擴增的DGGE分析采用35%～60%的變性凝膠梯度電泳，上樣量為30 μL、反應溫度為60℃、電壓130 V、電泳8 h；真菌DNA擴增的DGGE分析采用35%～70%的變性梯度，上樣量為30 μL、反應溫度為60℃、電壓120 V、電泳9 h。電泳后將DGGE膠用去離子水清洗，之后采用張巧云等［9］的方法對膠體進行銀染，并用相機進行拍照。

2.4基因測序分析

對膠體中的條帶進行切膠，并用清水進行清洗，搗碎，加入50 μL去離子水，在4℃冰箱過夜，以上清液為模板，采用沒有GC夾的引物進行PCR擴增，之后將PCR產物送往蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序分析。將基因測序結果在GENBANK數據庫中進行Blast比對，對菌株進行定性分析。

3　結果與分析

3.1粘豆包酸面團DNA樣品PCR擴增

用1%的瓊脂糖凝膠電泳分別對粘豆包酸面團細菌DNA擴增產物和真菌DNA擴增產物進行檢驗，結果如圖1所示。

圖1　不同地區樣品DNA擴增產物Fig.1　Amplification product of DNA of samples from different region

圖1（a）中，4個樣品的細菌DNA PCR擴增產物的目的條帶都在200 bp左右，條帶清晰均一，可以認定細菌16S rRNA V3區的PCR產物。圖1（b）中，4個樣品的真菌DNA PCR擴增產物的目的條帶都在250 bp左右，條帶清晰均一，可認定為真菌26S rRNA D1/D2區的目的條帶。因此上述PCR產物均可用于后續的DGGE分析。

3.2不同地區粘豆包酸面團細菌多樣性分析

利用DGGE電泳技術分析不同地區粘豆包酸面團中細菌的多樣性，結果如圖2所示。

在4個樣品中共發現了7個不同位置的條帶，這說明在粘豆包酸面團中細菌的多樣性較為豐富，且4個來自不同地區的樣品中細菌多樣性也存在著一定差異。此外，樣品B（哈爾濱市賓縣）和樣品D（綏化市青岡縣）的DGGE圖譜比較接近，這兩個樣品分別來自哈爾濱市賓縣和綏化市的青岡縣，樣品C（雙鴨山市寶清縣）的DGGE圖譜與其他3個樣品有明顯的差距，這可能是因為粘豆包酸面團是天然發酵的食品，其中的微生物組成與地域有一定的聯系，在地理位置上樣品B和樣品D比較接近，而樣品C在地理位置上遠離其他3個樣品。

圖2　不同地區樣品細菌DGGE圖譜Fig.2　DGGE profile of the bacteria of DNA of samples from different regions

將7個不同的條帶進行膠回收、PCR擴增和基因測序，測序結果如表1所示。

表1　不同地區樣品細菌和真菌DGGE圖譜中條帶Blast對比結果Table 1　Blast result of bands in DGGE profiles of bacteria and fungi of samples from different regions

7個條帶代表了7個不同的菌種，分別為：植物乳桿菌（Lactococcus fermentum）、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）、食竇魏斯氏菌（Weissella.cibaria）、乳酸乳球菌（L.lactis）、短乳桿菌（L.brevis）和融合魏斯氏菌（Weissella confusa），其中代表植物乳桿菌、檸檬明串珠菌和短乳桿菌的條帶雖然亮度不一，但是這些菌都出現了4個粘豆包酸面團樣品中。羅伊氏乳桿菌和食竇魏斯氏菌只出現在了樣品B和樣品C中，融合魏斯氏菌只出現在了樣品C中。

3.3不同地區粘豆包酸面團真菌多樣性分析

利用DGGE電泳技術分析不同地區粘豆包酸面團中真菌的多樣性，結果如圖3所示。

圖3　不同地區樣品真菌DGGE圖譜Fig.3　DGGE profile of the fungi of DNA of samples from different regions

在4個樣品中共發現了4個不同位置的條帶，可見粘豆包酸面團真菌的多樣性低于細菌的多樣性。在4個來自不同地區的樣品中，樣品A（牡丹江市東寧縣）的真菌條帶最多。分析原因，牡丹江市東寧縣位于黑龍江省的最南邊，真菌的多樣性很可能與當地的溫度氣候有關。通過基因測序分析（表1）可知：4個不同的條帶分別代表：米根霉（Rhizopus oryzae）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和異常畢赤酵母（Pichia anomala）。其中米根霉只在樣品A中出現，異常畢赤酵母只在樣品B（哈爾濱市賓縣）中出現。

4　討論

在采集自黑龍江省不同縣的粘豆包酸面團中，細菌的多樣性高于真菌的多樣性，且在細菌中以乳桿菌屬為優勢的菌屬，這一研究結果與Liu T等的發現一致［10］。在4份樣品中，植物乳桿菌、檸檬明串珠菌、熱帶假絲酵母和釀酒酵母均被檢測到且條帶顏色較深，這說明上述微生物在粘豆包酸面團的發酵過程中發揮了重要的作用，而在Zhang G等的研究也證明了上述結果［4］。此外，在個別的樣品中羅伊氏乳桿菌、食竇魏斯氏菌、乳酸乳球菌、短乳桿菌、融合魏斯氏菌、米根霉、異常畢赤酵母也被發現，這些微生物都具有一定的發酵能力，能夠產生獨特的風味和口感。上述結果啟發我們可以利用上述發酵微生物的混合物作為發酵劑應用于粘豆包的工業生產中，而發酵微生物的種類和配比還需進一步的研究。

同時，我們分析了不同地區粘豆包酸面團中微生物的多樣性，發現粘豆包酸面團中微生物的多樣性及微生物種類與樣品采集地點具有一定的聯系。在采集地較近的樣品中細菌多樣性較近，在較北的雙鴨山寶清地區細菌的種類明顯與其他3個樣品不同，而在溫度較高的牡丹江東寧地區真菌的多樣性較高，且組成與其他地區不同。在楊健等［5］的研究中，樣品采集地為黑龍江省肇州縣，主要的菌株有地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、發酵乳桿菌、短乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和醋化醋桿菌等，其中地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和醋化醋桿菌在我們的研究中并沒有發現，同時出現在本研究中的一些具有發酵能力的微生物在肇州縣粘豆包酸面團中也并被發現，這進一步說明了粘豆包酸面團中微生物的多樣性具有一定的地域特色。

［1］孫大慶，李洪飛，楊健，等.東北粘豆包中一株羅伊氏乳桿菌的分離、鑒定與益生性質研究［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2015（5）: 106-110

［2］劉少才.東北的老粘豆包［J］.中國保健食品，2014（12）:70-70

［3］李琦，程建軍，李文鵬.發酵糯玉米粘豆包的優選乳桿菌鑒定篩選［J］.東北農業大學學報，2008，39（5）:106-109

［4］Zhang G，Sadiq F A，Zhu L，et al.Investigation of Microbial Communities of Chinese Sourdoughs Using Culture-Dependent and DGGEApproaches［J］.Journal of Food Science，2015，80（11）:M2535-M2542

［5］楊健，孫大慶.東北粘豆包發酵面團中細菌多樣性研究［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2015（5）:78-81

［6］Chen T，Deng K，Xin L，et al.Effect of the Different Composition of Wheat，Rice，Buckwheat，Sweet Potato and Corn on Sourdough Characteristics and Sensory of Mantou［J］.J Nutr Food Sci，2015，5:336 doi:10.4172/2155-9600.1000366

［7］費鵬，白洪健，程述震，等.PCR-DGGE法分析嬰兒腸道菌群多樣性［J］.食品與機械，2013，29（2）:60-63

［8］姚笛，孫大慶，李洪飛.東北粘豆包酸面團菌群多樣性與自制酸面團中菌群變化規律的研究［J］.現代食品科技，2015（5）:90-95

［9］張巧云，孟祥晨.幾種發酵豆醬的微生物組成及理化性質分析［J］.食品科技，2013（8）:266-270

［10］Liu T，Li Y，Chen J，et al.Prevalence and diversity of lactic acid bacteria in Chinese traditional sourdough revealed by culture dependent and pyrosequencing approaches［J］.Lwt-Food Science and Technology，2016，68:91-97

Microbial Diversity Analysis of Sticky Bean Bun Sourdough from Different Regions

TAO Dong-ya1，JIN Yin-qi2
（1.Mechanical and Electrical Engineering College，Taizhou Vocational and Technical College，Taizhou 318000，Zhejiang，China；2.Taizhou Guang-yue Drinking Water Equipment Co.，LTD.，Taizhou 318020，Zhejiang，China）

In this study，as the research objects，the sticky bean bun sourdough from different regions were collected，and analyzed using the denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and gene sequencing technology to reveal the diversity of bacteria and fungi in these samples.The results showed that the diversity of bacteria was higher than that of fungi in all four samples.There were seven different bacteria strains，and four different fungi strains，among them，the Lactobacillus was The most abundant genus.By comparing the diversity of samples from different regions，it was found that there was a connection between microbial diversity of sticky bean bun and collection regions.

sticky bean bun sourdough；microbial diversity；denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）；gene sequencing

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.037

2014年浙江省生態省建設目標責任制考核重大科技項目；臺州市科技計劃重點項目（14GY07）；2014年度浙江省高校國內訪問工程師校企合作項目（FG2014131）

陶東婭（1983—），女（漢），講師，碩士研究生，主要研究方向：純水機控制、食品機械。

2016-04-19