超聲輔助多菌種發(fā)酵制備葛根酵素的研究

王振斌，劉加友，嚴賢，陳兵兵（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

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超聲輔助多菌種發(fā)酵制備葛根酵素的研究

王振斌，劉加友，嚴賢，陳兵兵
（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

以葛根為原料，植物乳桿菌和釀酒酵母為發(fā)酵菌種，在考察超聲時間、超聲強度和發(fā)酵液pH對發(fā)酵菌種產蛋白酶和脂肪酶影響的基礎上，利用響應面優(yōu)化超聲波促進多菌種發(fā)酵制備葛根酵素的最佳工藝。試驗結果表明超聲波促進多菌種混菌發(fā)酵制備葛根酵素的最佳條件為：pH為4.87，超聲時間82.95 min，超聲強度0.14 W/cm3時，葛根酵素的蛋白酶和脂肪酶分別達到55.32 U/mL和125.9 U/mL，經試驗驗證，在此條件下的蛋白酶、脂肪酶酶活與預測值接近。本文旨在為超聲促進發(fā)酵制備葛根酵素飲料提供理論支撐，也為酵素飲品的酶活指標提供參考。

超聲；發(fā)酵；酵素；葛根

葛根為豆科葛屬（Pueraria D.C.）植物，既是傳統(tǒng)的中藥又是保健食品［1］。據報道葛根中含有超過70種功能性化合物，營養(yǎng)豐富，特別是葛根中的黃酮等三萜類化合物，在改善心腦血管循環(huán)、降低心肌耗氧量、降低血糖、防止高血壓及動脈硬化、抗炎、祛痰、解熱、提高機體免疫力、抗菌和抗病毒等具有多種藥理作用［2-5］。利用植物乳桿菌和酵母菌發(fā)酵葛根液，一方面能夠保留葛根原本的營養(yǎng)物質，另一方面還能提高葛根黃酮的提取率，符合葛根黃酮提取工藝的發(fā)展趨勢，最重要的是植物乳桿菌和酵母菌發(fā)酵還能產生蛋白酶和脂肪酶等代謝產物，制備一種新型保健飲料—酵素，同時也為酵素飲品中脂肪酶和蛋白酶指標的定義提供理論參考。

酵素是一種以乳酸菌、酵母菌等益生菌發(fā)酵果品、蔬菜而形成的一種富含脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶以及乳酸、醋酸及少量乙醇等營養(yǎng)成分的液體或固體食品，具有消炎抗菌、抗氧化、解酒護肝、美白和改善腸道微環(huán)境的作用［6-9］，由于目前傳統(tǒng)的酵素生產周期較長、價格昂貴，因此縮短酵素發(fā)酵時間，降低酵素產品價格的研究需要迫切開展。

超聲波是指頻率大于20 kHz、頻率低而能量高的功率型超聲波，具有熱效應、空化效應、機械效應和生物效應［10］。張元標等［11］用18 kHz，3 W的超聲波輻照海水小球藻，其生長速率可為對照組的1.86～2.26倍，脂肪酸不飽度亦比對照組提高7.7%～12.5%。研究還發(fā)現(xiàn)微生物細胞在適宜強度的超聲作用下也會加快生長速度。高大維等［12］采用低強度超聲輻照對數生長期的啤酒酵母細胞，細胞生長速率提高，細胞干重也有所增加，說明超聲波對啤酒酵母細胞有促進生長的作用，因此本文基于上述研究，在單因素的基礎上，采用響應面優(yōu)化超聲技術促進植物乳桿菌和酵母菌來發(fā)酵制備葛根酵素的工藝參數，為超聲波技術在促進葛根酵素發(fā)酵中的應用提供參考。

1　材料和方法

1.1材料及試劑

葛根：來自句容茅寶葛業(yè)有限公司；釀酒酵母：購買于安琪酵母公司；乳酸菌：來自于江蘇大學食品學院實驗室分離的植物乳桿菌；福林酚試劑：來自于國藥試劑自制；琥珀酸二辛酯磺酸鈉、異辛烷、三油酸甘油酯、油酸、吡啶、苯、醋酸銅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等：均是分析純，來自國藥集團的化學試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母浸膏5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、吐溫-80 1 mL，瓊脂15 g～20 g，溶解于1 000 mL水中，調節(jié)pH值至6.2～6.4，115℃滅菌25 min。

1.2試驗儀器

HH-A恒溫水浴攪拌器：江蘇金壇市中大儀器廠；UV1000可見光分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；TGL-16M高速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；W-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；脈沖多頻掃描超聲儀：無錫市上佳生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1葛根的處理

將葛根丁60℃的熱風烘干，60目粉碎，將葛根粉與蒸餾水按照料液比1∶15（g/mL）混合均勻，煮沸糖化1.5 h，加入50 g紅糖，30 g蜂蜜，離心取上清液，調節(jié)發(fā)酵液的pH，均分放入5個1 L錐形瓶中，滅菌，備用。

1.3.2菌種的活化

乳酸菌的活化：活化菌種在MRS液體培養(yǎng)基中進行，32℃培養(yǎng)箱中傳代2次～3次，使菌種數量達到109CFU/mL，然后加入發(fā)酵液體積的3%。

酵母菌的活化：將活性干酵母加入到2%的葡萄糖，在30℃的條件下進行活化3 h～5 h，然后加入發(fā)酵液體積的3%。

乳酸菌菌落數根據平板計數法，參照GB 4789.35-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》；酵母菌的計數參考文獻［13］。

1.3.3粗酶液的分離與蛋白酶、脂肪酶酶活的測定

將發(fā)酵好的發(fā)酵液在4℃下，5 000 r/min離心20 min，取其上清液即為粗酶液。

蛋白酶酶活的測定方法參考文獻［14］。蛋白酶酶活定義：40℃1 min水解酪蛋白產生1 μg酪蛋白定義為一個蛋白酶活力單位（U）。

脂肪酶酶活的測定方法參考文獻［15］。脂肪酶定義：30℃1 min內產生1 μmol油酸所需的脂肪酶量為一個活力單位（U）。

1.3.4pH、超聲時間、超聲強度對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響

1）pH對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響

按照1.3.1的方法制備葛根發(fā)酵液，分別調節(jié)pH至4.5、5.0、5.5、6.0后各接入發(fā)酵液3%的乳酸菌和酵母菌，在32℃下培養(yǎng)發(fā)酵，分別在26、34、58、82、106 h考察初始pH對菌種產蛋白酶和脂肪酶的影響。

2）超聲時間對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響

按照1.3.1的方法制備葛根發(fā)酵液，各接入發(fā)酵液3%的乳酸菌和酵母菌，然后分別在超聲30、60、90、120 min，在32℃下培養(yǎng)發(fā)酵，分別在26、34、58、82、106 h考察初始pH對菌種產蛋白酶和脂肪酶的影響。

3）超聲強度對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響

按照1.3.1的方法制備葛根發(fā)酵液，各接入發(fā)酵液3%的乳酸菌和酵母菌，然后分別超聲30、60、90、120min，在32℃下培養(yǎng)發(fā)酵，分別在26、34、58、82、106 h考察初始pH對菌種產蛋白酶和脂肪酶的影響。

1.3.5超聲促進乳酸菌、酵母菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

本試驗采用Box-Bohnken中心組合試驗設計，根據單因素試驗結果分析確定因素水平，以蛋白酶酶活、脂肪酶酶活為響應值，設計三因素三水平的響應面分析（Response surface methodology，RSM）試驗。試驗以隨機次序進行，重復兩次，采用Design-Expert軟件進行響應面分析優(yōu)化乳酸菌、酵母菌發(fā)酵條件，響應面因素與水平表見表1。

表1　因素水平表Table 1　Factor levels table

2　結果與分析

2.1pH對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響

pH對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響見圖1。

圖1　pH對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶的影響Fig.1　The influence of pH on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

由圖1可知，初始pH對乳酸菌和酵母菌產蛋白酶酶活影響顯著。當pH為4.5時，乳酸菌、酵母菌產生的酶活活性較低。當pH為5.0時，蛋白酶酶活達到最強；然后隨著pH的增大，蛋白酶酶活呈現(xiàn)降低趨勢，分析原因可能是發(fā)酵液中的乳酸菌為優(yōu)勢菌群，抑制了酵母菌的生長。隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白酶酶活趨向穩(wěn)定，原因可能是發(fā)酵進程結束，沒有可利用的還原糖供乳酸菌和酵母菌利用。

pH對乳酸菌、酵母菌產脂肪酶的影響見圖2。

圖2　pH對乳酸菌、酵母菌產脂肪酶的影響Fig.2　The influence of pH on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase

由圖2可知，初始pH對乳酸菌和酵母菌產脂肪酶酶活具有顯著影響。在發(fā)酵26 h時，此時的脂肪酶酶活沒有較大差異，隨著發(fā)酵的進行，此時的脂肪酶酶活呈現(xiàn)上升的趨勢，當初始pH為5.0時，發(fā)酵時間58 h，此時的脂肪酶酶活最大。

2.2超聲時間對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響

超聲時間對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶的影響見圖3。

圖3　超聲時間對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶的影響Fig.3　The influence of ultrasonic time on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

由圖3可知，超聲時間對乳酸菌和酵母菌產蛋白酶影響顯著。在發(fā)酵初期施加90 min的超聲，發(fā)酵26 h時，乳酸菌和酵母菌產蛋白酶酶活上升趨勢明顯，與其他超聲組相比，蛋白酶酶的活性明顯高于其他組。

超聲時間對乳酸菌、酵母菌產脂肪酶的影響見圖4。

圖4　超聲時間對乳酸菌、酵母菌產脂肪酶的影響Fig.4　The influence of ultrasonic time on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase on lipase

由圖4可知，超聲時間對脂肪酶酶活的影響顯著。在發(fā)酵前期分別施加不同時間的超聲，施加超聲組的脂肪酶活除超聲120 min外不僅明顯高于空白組，而且提前達到最大酶活。

2.3超聲強度對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響

超聲強度對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶的影響見圖5。

由圖5可知施加不同強度的超聲波對乳酸菌和酵母菌產蛋白酶有明顯作用。當施加0.05、0.10、0.20 W/cm3的超聲密度時，蛋白酶酶活在58 h達到最大；特別是施加0.15 W/cm3的超聲密度組，蛋白酶酶活顯著高于其他組，特別是空白組。

超聲強度對乳酸菌、酵母菌產脂肪酶的影響見圖6。

圖5　超聲強度對乳酸菌、酵母菌產蛋白酶的影響Fig.5　The influence of ultrasonic intensity on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

圖6　超聲強度對乳酸菌、酵母菌產脂肪酶的影響Fig.6　The influence of ultrasonic intensity on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase

由圖6可以看出施加不同強度的超聲波對乳酸菌和酵母菌產脂肪酶作用顯著。當施加0.20 W/cm3的超聲密度時，超聲波明顯抑制了乳酸菌和酵母菌，但隨著發(fā)酵的進行，脂肪酶酶活增加顯著。由于其他超聲組施加的超聲強度較小，沒有對乳酸菌和酵母菌產生較大的影響，脂肪酶酶活隨著發(fā)酵的進行呈現(xiàn)增大趨勢，特別是施加0.15 W/cm3的超聲組，脂肪酶酶活明顯高于其他組。

2.4超聲促進乳酸菌和酵母菌發(fā)酵的響應面優(yōu)化

基于單因素試驗結果分析，以蛋白酶和脂肪酶酶活為響應值，采用RSM法來尋求超聲促進乳酸菌和酵母菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數。Box-Behnken試驗設計及結果見表2，并利用Design Expert對響應面試驗結果進行方差分析。

表2　響應面設計方案和試驗結果Table 2　The response surface design scheme and test results

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance

各因素經二次多項回歸擬合后，分別得到Y1、Y2與pH、超聲時間、超聲強度3個因素的二次多項回歸方程為：

Y1=54.59-1.43X2-1.64X3+2.4X1X2-1.76X2X3-2.88 X12-3.81X22-4.04X32

Y2=120.71-5.86X3+5.52X1X2-6.95X2X3-7.31X22-7.04X32

從表3的方差分析結果可以看出，模型顯著，回歸模型可以用來擬合3個因素對乳酸菌和酵母菌產蛋白酶和脂肪酶的影響。回歸方程與實際數據之間具有良好的擬合性。從因素X1、X2、X3對蛋白酶和脂肪酶的影響來看，Y1方程的一次項X2、X3，二次項X12、X22、X32，交互項X1X2和X2X3均顯著。Y2方程的一次項X3，二次項X22、X32，交互項X1X2和X2X3均顯著，這說明響應值的變化十分復雜，試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是呈二次關系。

根據回歸方程，利用Design Expert作因子間的響應面分析圖。如圖7、圖8、圖9、圖10所示，直觀地反應了最為顯著的pH與超聲時間、超聲時間與超聲強度之間的交互作用對乳酸菌和酵母菌所產蛋白酶和脂肪酶酶活的影響。

圖7　pH和超聲時間交互作用對蛋白酶酶活的響應面圖及等高線圖Fig.7　Response surface and contour plot of pH and ultrasonic time interaction of protease enzyme activity

圖8　超聲時間和超聲強度交互作用對蛋白酶酶活的響應面圖及等高線圖Fig.8　Response surface and contour plot of ultrasonic time and ultrasonic intensity interaction of protease enzyme activity

圖9　pH和超聲時間交互作用對脂肪酶酶活的響應面圖及等高線圖Fig.9　Response surface and contour plot of pH and ultrasonic time interaction of lipase enzyme activity

圖10　超聲時間和超聲強度交互作用對脂肪酶酶活的響應面圖及等高線圖Fig.10　Response surface and contour plot of ultrasonic time and ultrasonic intensity interaction of lipase enzyme activity

通過分析計算得到超聲促進乳酸菌和酵母菌發(fā)酵最優(yōu)條件為：pH為4.87，超聲時間82.95 min，超聲強度0.14 W/cm3。此條件下，蛋白酶和脂肪酶發(fā)酵的最大酶活為為55.32 U/mL和125.90 U/mL。

2.5驗證試驗

為表明響應面模型的合適性和有效性，進行驗證試驗。在pH為4.87，超聲時間82.95 min，超聲強度0.14 W/cm3，重復3次，蛋白酶和脂肪酶發(fā)酵的最大酶活為為（55.32±3.52）U/mL和（125.90±4.12）U/mL，接近模型預測值。

3　結論

以葛根為原料，植物乳桿菌和釀酒酵母為發(fā)酵菌種，在pH為4.87，超聲時間82.95 min，超聲強度0.14 W/cm3時，葛根酵素的蛋白酶和脂肪酶分別達到55.32 U/mL和125.9 U/mL。結果不僅證實可以利用葛根作為原料來生產植物酵素，而且還為葛根酵素酶活標準的制定提供參考。

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The Research on Preparation of Kudzu Ferment by Mixed Bacteria with Ultrasonic Wave

WANG Zhen-bin，LIU Jia-you，YAN Xian，CHEN Bing-bing
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）

The kudzu and lactobacillus plantarum，saccharomyces cerevisiae were taken as material and pzymocyt respectivity.On the base of the effect of ultrasonic time，ultrasonic intensity and initial pH on protease and lipase activity，reponse surface was applicated in the optimizing process of preparation of kudzu ferment by mixed bacteria with ultrasonic wave.The results were showed that：pH 4.87，ultrasonic time 82.95 min，ultrasonic intensity 0.14 W/cm3，the protease and lipase activity were arrived at 55.32 U/mL and 125.9 U/mL.After the verification test，protease and lipase activity were closed to the predictive value.The paper was offered not merely theoretical support but also enzyme activity reference for ferment preparation.

ultrasonic wave；fermentation；ferment；kudzu

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.038

江蘇鎮(zhèn)江市科技支撐計劃（No.NY2012013；GY2012021）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）；江蘇大學研究生科研創(chuàng)新項目（No.KYXX0047）

王振斌（1975—），男（漢），教授，碩士生導師，研究方向：發(fā)酵食品加工、功能食品加工。

2015-07-03