添加胰島素對胎兒宮內發育遲緩新生仔豬胰腺生長發育的影響

薛萍　王恬（1.福建農業職業技術學院動物科學系福州350119；2.南京農業大學動物科技學院210095）

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添加胰島素對胎兒宮內發育遲緩新生仔豬胰腺生長發育的影響

薛萍1，2王恬2*
（1.福建農業職業技術學院動物科學系福州350119；2.南京農業大學動物科技學院210095）

（目的和方法）為研究添加胰島素對IUGR新生仔豬胰腺重量、酶活性的影響，試驗選擇初生IUGR仔豬15頭，分為新生對照組（N）、牛乳組（M）和試驗組即牛乳添加胰島素（60 IU/L）組（I），人工飼喂3 d后宰殺取樣。（結果）結果顯示，與N組相比，飼喂3 d后，M組和I組仔豬胰腺重量、胰腺重/體重、蛋白質含量、DNA含量、RNA含量、胰淀粉酶活性、胰脂肪酶總活性、胰高血糖素總含量均不同程度提高，而胰總蛋白水解酶活性、胰蛋白酶活性、胰糜蛋白酶總活性、胰腺胰島素總含量均不同程度降低，變化較明顯。與M組相比，I組胰腺蛋白質含量、蛋白質/DNA比值分別提高了61.43%、60.54%（P＜0.01）；I組胰總蛋白水解酶活性、胰淀粉酶活性、胰脂肪酶總活性、胰腺胰島素總含量、胰高血糖素含量分別提高了10.59%、10.40%、9.37%、14.30%、12.30%（P＞0.05）；胰腺重、胰腺重/體重、胰腺DNA含量、RNA含量、RNA/DNA比值也不同程度提高（P＞0.05）；而I組與M組間胰蛋白酶活性、胰糜蛋白酶活性差異不顯著。（結論）表明IUGR仔豬生后胰腺生長發育較迅速，添加胰島素能在一定程度上刺激IUGR仔豬胰腺細胞增殖和增大，能顯著促進IUGR仔豬胰腺蛋白質合成和沉積，有刺激胰腺內外分泌部發育、提高胰腺酶活性提高、刺激組織激素分泌的趨勢，對IUGR仔豬出生后胰腺的生長具有一定的補償作用。

胰島素IUGR豬胰腺生長發育

在母豬懷孕期間，若營養攝入不平衡、腸道吸收功能不良、食入飼料毒素、環境應激或管理不當，初生仔豬發生胎兒宮內發育遲緩（Intrauterine growth retardation，IUGR）的比率高達9%～11%，造成小豬體重低、消化系統功能障礙、生長緩慢或死亡，影響生產效益。因此，研究通過營養調控手段促進IUGR仔豬出生后消化系統的生長發育，從而促進仔豬的補償生長是非常重要的。目前，關于調控IUGR仔豬出生后胰腺生長發育的研究報道非常少。胰島素是一種乳中天然存在的生物活性肽，在新生動物早期胃腸道快速發育過程中發揮著重要的生物學功能，其主要作用是促進糖原、蛋白質、脂肪合成，抑制其分解。本試驗通過在乳中添加胰島素研究其對新生IUGR仔豬胰腺生長發育的影響，以期為豬生產中促進IUGR仔豬出生后補償生長、提高生產效益提供依據。

1　材料與方法

1.1試驗動物及試驗設計IUGR仔豬選擇標準：采用Xu等的兩個標準差法［1］。對蘇州市第一種豬場蘇太豬多年生產記錄進行統計分析，獲得該豬種新生仔豬的平均初生重和標準差，體重低于平均體重兩個標準差的新生仔豬被確定為IUGR仔豬。

試驗選用蘇太豬（太湖豬×杜洛克），采用隨機區組設計。從5窩初生仔豬中選出15頭（每窩選3頭）IUGR仔豬，隨機分到新生對照組（N），牛乳組（M）和試驗組即牛乳添加胰島素組（I）。M和I組仔豬全部在吮乳前稱取初生重，人工飼喂3 d，M組喂牛乳，I組在牛乳中添加60 IU/L胰島素。飼喂量按每千克體重30 mL/次，3 h飼喂一次。飼喂結束稱重、屠宰取樣。

1.2試驗材料

1.2.1牛乳乳粉（Fernleaf）與蒸餾水按1：6體積比例混合成試驗用牛乳。混合后每100 mL牛乳含熱量3.100 MJ、蛋白質3.69 g、乳糖5.99 g、脂肪3.96 g、維生素A 448 IU、維生素D 60 IU、維生素C 7.5mg。

1.2.2I組牛乳添加胰島素的配制I組在牛乳中添加胰島素60 IU/L。胰島素（提取自牛胰腺）為SIGMA公司產品，26.5 U/mg。經檢測牛乳中胰島素的濃度為0.34m IU/L。

1.3樣本采集仔豬心臟采血致死后，迅速分離消化器官，置于冰盤上，并立即從系膜連接的消化器官中迅速分離出胰腺（剝除多余的脂肪和結締組織），稱重，貯存于-70℃超低溫冰箱備用。

1.4胰腺組織指標測定將冷凍保存的胰腺組織樣本于4℃下解凍，用眼科小剪剪碎，加入冷生理鹽水勻漿備用。

1.4.1蛋白質、DNA和RNA含量的測定將冷凍保存的胰腺組織樣本于4℃下解凍，用眼科小剪剪碎，加入冷生理鹽水勻漿備用。采用Lowry等（1951）改良福林酚試劑法［2］測定胃組織勻漿中蛋白質含量。用John-Chandler法［3］提取組織勻漿中的DNA和 RNA，并采用Giles和Myers（1965）改良的Burton二苯胺法［4-5］測定DNA含量，Fleck和Begg（1994）的紫外吸收法［6］測定RNA含量。

1.4.2胰酶活性的測定采用福林酚法測定胰總蛋白水解酶活性［7］，Geiger和Fritz（1984）的方法［8］測定胰蛋白酶活性，Geiger（1984）的方法［9］測定胰糜蛋白酶活性。采用南京建成生物工程研究所的醫用淀粉酶試劑盒測定胰淀粉酶活性。參照比濁法測定胰腺組織中的脂肪酶活性［10］。

1.4.3胰島素和胰高血糖素含量的測定組織中胰島素和胰高血糖素含量分別采用中國原子能科學研究院同位素研究所提供的125I-胰島素放射免疫分析試劑盒和125I-胰高血糖素放射免疫分析試劑盒測定。

1.5統計分析采用SPSS 11.5軟件進行統計分析。各組間采用單因子方差（One-Way ANOVA）分析，多重比較采用最小顯著差數法（LSD）。數據以平均值±標準差（±SD）表示。

2　結果與分析

2.1體重和胰腺重由表1可見，與N組相比，M組、I組仔豬體重均減輕；M組與I組間差異不顯著（P＞0.05）。M組和I組胰腺重量分別比N組提高了29.64%和38.93%（P＜0.01），且I組高于M組，差異不顯著。M組和I組仔豬胰腺重/體重比值（胰腺相對重量）分別比N組提高了38.19%和49.61%（P＜0.01），且I組高于M組（P＞0.05）。

2.2胰腺蛋白質、DNA和RNA含量及蛋白質/ DNA由表2可見，與N組相比，M組和I組胰腺蛋白含量分別提高了29.54%和109.11%（P＜0.01）；I組較M組高61.43%，差異達到極顯著水平（P＜0.01）。與N組相比，M組和I組胰腺DNA含量分別提高了42.27和42.82%（P＜0.01）；I組胰腺DNA含量略高于M組，但差異均未達到統計學顯著水平（P＞0.05）。與N組相比，M組和I組胰腺RNA含量極顯著提高（P＜0.01）；I組高于M組（P＞0.05）。與N組相比，M組和I組仔豬胰腺RNA/DNA比值分別提高了12.71%（P＞0.05）和21.45%（P＜0.05）；I組高于M組（P＞0.05）。與N組相比，M組仔豬胰腺蛋白質/DNA比值略微降低（P＞0.05），而I組仔豬極顯著提高（P＜0.01）；I組蛋白質/DNA較M組高60.54%（P＜0.01）。

表2　添加胰島素對IUGR仔豬胃蛋白質、DNA、RNA含量的影響

2.3胰酶活性三組試驗仔豬胰總蛋白水解酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶總活性見表3。由表3可見，與N組相比，M組和I組仔豬胰總蛋白水解酶活性、胰蛋白酶活性均極顯著降低（P＜0.01）；且I組胰總蛋白水解酶活性較M組高10.59%（P＞0.05）；I組與M組間胰蛋白酶活性差異不顯著（P＞0.05）。與N組相比，M組和I組胰糜蛋白酶總活性分別降低了20.95%（P＜0.05）和19.47%（P＞0.05）；I組和M組間差異不顯著（P＞0.05）。與N組相比，M組和I組仔豬胰淀粉酶活性均極顯著提高（P＜0.01）；而I組較M組高10.40%（P＞0.05）。與N組相比，M組和I組胰脂肪酶總活性分別提高17.88%（P＞0.05）和28.92%（P＜0.01）；而I組較M組高9.37%（P＞0.05）。

2.4胰島素和胰高血糖素含量由表4可見，與N組相比，M組和I組胰腺胰島素總含量均不同程度降低（P＞0.05）；I組較M組高14.30%（P＞0.05）。與N組相比，M組和I組胰高血糖素總含量分別提高了56.64%和76.99%（P＜0.05）；I組較M組高12.30%（P＞0.05）。

表3　添加胰島素對IUGR仔豬胰總蛋白水解酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶總活性的影響

表4　添加胰島素對IUGR仔豬胰島素和胰高血糖素含量的影響

3　討論

消化器官的生長發育會影響動物體重的增長和身體其他各系統的功能。胰腺雖小，但它是動物消化系統中一個極為重要的兼具內、外分泌功能的腺體，外分泌主要成分是胰液，內含堿性的碳酸氫鹽和各種消化酶，其主要功能是中和胃酸，消化糖、蛋白質和脂肪；內分泌可合成和分泌胰高血糖素、胰島素、生長抑素、胰多肽。動物器官的生長發育與細胞的數量、大小、分化密切相關，蛋白質含量、DNA含量、蛋白質與DNA含量的比值是衡量細胞數量、細胞大小的重要指標［11］。石現瑞等（2005）試驗結果表明，IUGR仔豬胰腺重量、蛋白質含量、DNA含量和RNA含量、胰腺腺泡大小和腺泡細胞大小、胰蛋白酶總活性、胰凝乳酶總活性、胰脂肪酶總活性、胰淀粉酶總活性均不同程度低于正常仔豬，提示IUGR顯著影響仔豬胰腺的重量、生化組成和酶的活性［12］。

胰島素是初乳中重要生長因子之一，一些體內外研究表明，胰島素能夠顯著促進腸道上皮細胞增殖，促進腸道蛋白質合成，提高消化酶活性［13-15］。沈峰等（2005）添加本試驗相同劑量胰島素飼喂IUGR仔豬發現，口飼胰島素能顯著提高IUGR仔豬小腸黏膜DNA、RNA含量，刺激小腸黏膜上皮細胞的增生和小腸黏膜麥芽糖酶、乳糖酶總活性的升高［16］。但目前有關通過外源添加胰島素對IUGR仔豬胰腺生長發育的影響未見報道。本試驗研究發現，與自然哺乳仔豬相比，IUGR仔豬人工飼喂牛乳或牛乳補加胰島素3 d后，胰腺各生長發育指標的變化規律相差不明顯，均可促進胰腺迅速生長發育；與僅喂牛乳組相比，牛乳添加胰島素組仔豬胰腺蛋白質含量、蛋白質/DNA極顯著提高（P＜0.01），胰腺重/體重、胰腺DNA含量、RNA含量、胰總蛋白水解酶活性、胰淀粉酶活性、胰脂肪酶總活性、胰腺胰島素總含量、胰高血糖素含量也不同程度提高（P＞0.05）。表明IUGR仔豬出生后胰腺生長發育較迅速，添加胰島素能在一定程度上刺激IUGR仔豬胰腺細胞增殖和增大，顯著促進IUGR仔豬胰腺蛋白質合成和沉積，有刺激胰腺內外分泌部發育、提高胰腺酶活性、刺激組織激素分泌的趨勢，對IUGR仔豬出生后胰腺生長具有一定的補償作用。

胰島素調節新生仔豬胰腺生長發育的機制尚不十分清楚，綜合前人的研究［15-29］推測，胰島素能在新生動物胃腸道中穩定存在，可以完整的結構發揮生物活性作用，其對于早期仔豬腸道的影響可能更多的是直接作用于消化道表面，而不是被吸收后通過血液循環起作用；主要是通過與高親和力胰島素受體結合、與Ⅰ型胰島素樣生長因子（IGF-I）受體結合或促進肝臟釋放IGFs間接作用等方式，發揮促進細胞生長、促進細胞增殖分裂與分化、參與體內物質代謝和能量代謝等作用，且作用效果與細胞膜上胰島素受體密度、親和力、受體功能狀態以及受體后途徑等因素有關，與添加劑量和添加時間有關。若采用更大劑量、更長時間添加胰島素的方式，對IUGR仔豬出生后胰腺的生長發育、仔豬整體的生長發育是否存在更好的影響以及其作用機制還有待進一步深入研究。

［1］Xu R J,Mellor D J,Brittles M J,et al.Impact of intrauterine grow th retardation on the gastrointestinal tract and the pancreas in newborn pigs［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr, 1994,18：232-240.

［2］Low ry O H,Rosebrough N J,Farr A L,et al.Protein measurement w ith the Follin phenol reagent［J］.JBiol Chem, 1951,193：265-275.

［3］Johnson L R,Chandler A M.RNA and DNA of gastric and duodenalmucosa in antractomized and gastrin-treated rats［J］.Am JPhysiol,1973,224：937-940.

［4］Giles K,M yers A.An improved diphenylamine method for the estimation of deoxyribomucleic acid［J］.Nature, 1965,206：93.

［5］Burton K A.Study of the conditions and mechanism sof the diphenylam ine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid［J］.Biochem J,1965,62：315-323.

［6］Fleck A,Begg D.The estimation of ribonucleic acid using ultravioletabsorptionmeasurement［J］.Biochem Biophys Acta,1994,108：333-339.

［7］高雯,蔣培榮,張之佳,等.食品酶學分析方法［M］.哈爾濱：黑龍江科學技術出版社,1991.

［8］Geiger R,Hans F.Trypsin［M］.In：Bergmeyer H U.Methods of enzymatic analysis.3rd edition.W einhein,Verlag Chem ie,German,1984：119-124.

［9］Geiger R.Chymotrypsin［M］.In：Bergmeyer H U.M ethods of enzymatic analysis.3rd edition.Weinhein,Verlag Chem ie,German,1984：99-107.

［10］金宗廉,文鏡,唐粉芳,等.功能食品評價原理及方法［M］.北京：北京大學出版社,1995：107-109.

［11］Xu R J,Tungthanathanich P,Birtles M J,et al.Grow th and morphological logical changes in the small and the large intestine in pigs during the first three days after birth［J］.J Dev Physiol,1992,18：162-172.

［12］石現瑞,霍永久,王恬,等.子宮內發育遲緩對新生仔豬胰腺和胃發育的影響［J］.家畜生態學報,2005,25（1）：26-31.

［13］Arsenault P,Menard D.Insulin influences the maturation and proliferation of suckling mouse intestinal mucosa in serum-free organ cu-lture［J］.Biol Neonate,1984,46（5）：229-236.

［14］Shulman R J,Tivey D R,Sunitha I,et al.Effect of oral insulin on lactase activity,mRNA,and posttranscriptional processing in the new born pig［J］.JPediatr Gastroenterol Nutr,1992,2：166-172.

［15］鄒仕庚,王恬,鄭春田,等.胰島素和酶解配方乳對初生仔豬胃腸道生長發育影響的研究［J］.動物營養學報, 2001,213（1）：19-24.

［16］沈峰,王恬.胰島素對子宮內生長遲緩新生仔豬小腸生長發育的影響［J］.腸外與腸內營養,2005,12（1）：5-8.

［17］Wei Hua Shen.Gastrointestinal stability and absorption of insulin in suckling pigs［J］.Com parative Biochem istry and Physiology,2000,125（3）：389-401.

［18］Hill D J,N ilner R D G.Insulin asa grow th factor［J］.Rediatr Res,1985,9：879-886.

［19］Now ak JW,Styczyńska E,Slebodziński A B.Insulin receptors：the binding capacity and localization in the digestive tract during the rabbits neonatal period［J］.Reprod Nutr Dev,1996,36（5）：513-521.

［20］Termanini B,Nardi R V,Finan T M,et al.Insulin like grow th factor I receptors in rabbit gastrointestinal tract. Characterization and autoradiographic localization［J］.Gastoenterology,1990,99（1）：51-60.

［21］Chen M C,Lee A T,Soll A H.M itogenic response of canine fundic epithelial cells in short-term culture to transform ing grow th factor alpha and insulin like grow th factor I［J］.JClin Invest,1991,87（5）：1716-1723.

［22］伊正輝,王林杰,常迎彬.不同年齡大鼠胰腺組織中胰島素受體與磷脂酰肌醇3激酶表達水平的研究［J］.中國醫學創新,2012,9（14）：1-3.

［23］Obici S,Fang Z,KarkaniasG,et al.Decreasing hypothalam ic insulin receptor cause hyperphagia and insulin resistance in rats［J］.Nat Neurosci,2002,5（6）：566-572.

［24］Barreto SG,Carati C J,Toouli J,et al.The islet-acinar axis of the pancreas：more than just insulin［J］.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol,2010,299（1）：10-22.

［25］Philippe M F,Benabadji S,Barbot-Trystram L,etal.Pancreatic volume and endocrine and exocrine functions in patientsw ith diabetes［J］.Pancreas,2011,40（3）：359-363.

［26］Ralph A B,Edw ard A D.FOXO T ranscription Factors：Key Targetsof the PI3K-Akt Pathway that Regulate Cell Proliferation,Survival,and Organismal Aging［J］.Regulation of Organelle and Cell Compartment Signaling,2011,210（6）：43-51.

［27］Saltiel A R,Kahn C R.Insulin signaling and the regulation of glucose and lipidmetabolism［J］.Nature,2001,414（6865）：799-806.

［28］Ye H（葉華）.2型糖尿病患者及其一級親屬和非糖尿病者骨骼肌的胰島素信號傳導［J］.Clin JDiabetes（中國糖尿病雜志）,2003,11（2）：151-152.

［29］李瑤,辛穎.宮內發育遲緩大鼠胰腺肝臟骨骼肌中胰島素受體底物的表達［J］.中國循證兒科雜志,2011,6（3）：225-229.

Effects of oral insulin on the pancreatic grow th and development of IUGR pigs

Xue Ping1，2Wang Tian2*
（1.Departmentof Animal Science，Fujian Vocational College of Agriculture，350119；2.College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，210095）

Abstract（Objective and Method）In order to investigate the effects of oral insulin on the growth and development of pancreatic in intrauterine growth retardation（IUGR）piglets，fifteen Sutai IUGR pigletswere selected and divided into three groups：newborn group（N），milk group（M）and milk supplemented with insulin（60 IU/L）group（I）.The piglets in group M and Iwere fed artificially for 3 days，respectively.Compared with newborn group，pancreatic tissue weight，the raito tissue weight to body weight，content of protein，content of DNA，content of RNA，total activities of amylase and lipase，content of glucagon in bottled-fed pigletswere higher，but total activities of protease，trypsin，chymotrypsin，and content of insulin were lower.Compared with M group，content of protein，the ratio protein to DNA in pancreas of Igroup were increased by 61.43%、60.54%（P＜0.01），respectively.Compared with M group，total activities of protease，amylase and lipase，and content of Insulin and glucagon in pancreatic of group Iwere increased by 10.59%、10.40%、9.37%、14.30%、12.30%（P＞0.05），respectively.Compared with M group，pancreatic tissueweight，the raito tissueweight to bodyweight，content of DNA，content of RNA，the ratio RNA to DNA also showed the similar increased tendency（P＞0.05）.And these difference between total activities of trypsin and chymotrypsin in group M with these in group Ididn't reach statistical significantly level.（Conclusion）The results show that the pancreatic Growth and Development of IUGR piglets were quickly during the early postnatal period，and oral insulin could promote the proliferation and enlargement of pancreatic cells，and could promote synthetic and deposit of protein，and could promote the development of exocrine section and endocrine section in pancreatic to some extent，and could increase activities of protease enzyme，and could promote secretion of hormone，and could promote the pancreatic compensatory growth and development of IUGR Pigs.

Oral insulin IUGR Piglets Pancreas Growth and development

A

1003-4331（2016）03-0010-05

國家自然科學基金項目（30771569）資助。

薛萍，女，講師，碩士。主要從事單胃動物營養研究，xp200216@sina.com。

王恬，教授，博士生導師，tianwang@njau.edu.cn。