大豆SbPRP3基因表達及轉基因煙草非生物脅迫鑒定

翟　瑩，張　軍，楊曉杰，趙　艷，陳　陽

(1 齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2 黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005)

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大豆SbPRP3基因表達及轉基因煙草非生物脅迫鑒定

翟瑩1，張軍2，楊曉杰1，趙艷1，陳陽1

(1 齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2 黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005)

為研究大豆(GlycinemaxL.)細胞壁脯氨酸富集蛋白基因(SbPRP3)在逆境脅迫中的作用，利用實時熒光定量PCR，對SbPRP3在高鹽、干旱和低溫處理下的表達情況進行檢測。結果顯示，SbPRP3在高鹽處理下表達量升高，在干旱和低溫處理下表達量先升高后降低。將SbPRP3構建到植物表達載體pRI101-AN上并轉化煙草，獲得陽性轉基因煙草3株。對轉基因煙草植株進行高鹽、干旱和低溫脅迫處理。結果表明，與對照相比，高鹽和低溫處理下轉基因煙草脯氨酸積累量增加，而丙二醛產生量降低。但干旱處理后轉基因煙草脯氨酸和丙二醛的含量與對照相比沒有顯著差異。由此推測SbPRP3可以提高轉基因煙草的耐鹽性和耐寒性。

大豆；脯氨酸富集蛋白；SbPRP3；表達分析；抗逆性

植物細胞壁的組成和結構在細胞發育及應對不良環境因子時會發生變化。這些變化包括細胞壁中多糖(例如纖維素、果膠和半纖維素)以及結構蛋白含量的改變[1]。結構蛋白含量占植物細胞壁干重的10%左右，這些蛋白主要分為5類：富含羥脯氨酸糖蛋白(hydroxyprolin-rich glycoproteins, HRGPs)、茄科凝集素(Solanaceous lectins)、阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGPs)、甘氨酸富集蛋白(glycine-rich proteins, GRPs)和脯氨酸富集蛋白(proline-rich proteins, PRPs)[2-3]。PRPs是一類廣泛分布于植物中的富含脯氨酸和羥脯氨酸的蛋白質。自1985年首次在傷害誘導的蘿卜中被發現后，目前已在大豆、棉花、小麥和玉米等多種植物中發現PRPs的存在[4-7]。

研究表明，PRPs基因的表達通常受病原菌侵染、激素、傷害、低溫、干旱和高鹽脅迫等因素的影響[2]。例如，傷害、高溫、紫外線照射和干旱等都可以誘導菜豆脯氨酸富集蛋白基因PvSR1的表達[8]；冷脅迫可以誘導棉花中GhHyPRP4的表達[6]；低溫可以誘導油菜BnPRP的表達，而高溫、干旱和傷害則不影響其表達[9]。大豆中的2個PRPs基因，SbPRP和GmPRP均可被多種生物及非生物因子誘導上調表達，GmPRP可以提高轉基因擬南芥的耐鹽性[3,10-11]。相反，芝麻SiPRP和海島棉GbHyPRP1則受病菌誘導后下調表達[12-13]。這些結果表明，PRPs在植物應對生物和非生物脅迫的反應中可能發揮重要作用。

從大豆中最早分離出的3個PRPs基因：SbPRP1、SbPRP2和SbPRP3[5,14]。其中，SbPRP1主要在成熟的下胚軸、根部和未成熟胚種皮中表達，SbPRP2主要在下胚軸頂端表達，而SbPRP3則主要在葉片中表達，表明這3個基因表達具有明顯的發育階段特異性和組織特異性。但有關這3個基因在逆境條件下的表達情況及在大豆抗逆中發揮的作用并未見報道。本實驗對大豆SbPRP3基因在高鹽、干旱和低溫處理下的表達情況進行檢測，并將其轉化煙草進行抗性鑒定，為后續SbPRP3在抗逆育種中的應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料及處理

大豆(GlycinemaxL.)品種‘合豐46’由齊齊哈爾大學遺傳實驗室保存。將四葉期大豆幼苗置于含有200 mmol/L NaCl的MS培養液中進行高鹽處理；置于含有20% PEG8000的MS培養液中進行模擬干旱處理；置于4 ℃培養箱中進行低溫處理。分別處理0、1、2、5、10和24 h后取樣，剪取葉片迅速置于液氮中，-80 ℃保存備用。

1.2方法

1.2.1總RNA提取與cDNA 合成采用Plant RNAzol試劑(鼎國公司)提取大豆不同處理時間點葉片的總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒(鼎國公司)說明書合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2實時熒光定量PCR分析根據SbPRP3基因序列(GenBank登錄號J05209)設計熒光定量PCR引物YF(5′-GGCTTCCTTTGTATCCTTCCTA-3′)和 YR(5′-ATGGGTGTTGTCCTCTACTGG-3′)。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀上，以大豆組成型表達基因β-Tubuin(GenBank登錄號GMU12286)作為內參基因，引物為TF(5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′)和 TR(5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′)，以大豆不同處理時間點葉片cDNA為模板。反應體系為2×SYBR Premix ExTaq(TaKaRa公司)10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、cDNA 2 μL、正反向引物各 0.4 μL，雙蒸水補至總體積20 μL。反應程序為95 ℃預變性10 s，95 ℃變性 20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。各處理均做3次重復，計算基因的相對表達量。試驗結果利用BIO-RAD CFX Manager軟件進行數據分析。

1.2.3植物表達載體構建根據SbPRP3基因序列設計引物JF(5′-ACGCGTCGACATGGCTTCCTTTGTATCCTTCC-3′)和JR(5′-GGAATTCGCTTGCTTTAGGCATGGGTG-3′，下劃線分別代表SalⅠ和EcoRⅠ酶切位點)，從大豆葉片cDNA中擴增SbPRP3基因全長序列(退火溫度59 ℃)。PCR產物經切膠回收后連接至pMD-18T載體上，送上海生工生物工程公司測序。測序正確后，將目的基因連接到pRI101-AN植物表達載體上。重組載體轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，經質粒雙酶切鑒定后采用凍融法轉化根癌農桿菌EHA105。

1.2.4煙草轉化用含有植物表達載體pRI101-SbPRP3的農桿菌菌液經葉盤法轉化煙草NC89[15]，MS培養基中卡那霉素篩選濃度為50 mg/L。以具有卡那霉素抗性的煙草轉化幼苗葉片cDNA為模板，pRI101-SbPRP3質粒為陽性對照，非轉基因煙草葉片cDNA為陰性對照，進行轉基因植株的RT-PCR鑒定。單株收獲T0代呈陽性植株的種子，將其繼續在含有30 mg/L卡那霉素的MS培養基上進行抗性篩選，獲得T1代抗性植株。繼續對T1代抗性植株葉片進行RT-PCR檢測，獲得T1代陽性轉基因植株。

1.2.5轉基因煙草非生物脅迫處理選取T1代中RT-PCR目的條帶最亮的轉基因株系進行非生物脅迫抗性鑒定。將正常生長于花盆中6周齡野生型煙草和T1代轉基因煙草用400 mmol/L NaCl水溶液澆透，處理5 h，進行鹽脅迫處理；停止澆水10 d，進行干旱脅迫處理；煙草連同花盆一起置于4 ℃培養箱中12 h，進行冷脅迫處理。每個處理3次重復。脯氨酸含量測定采用Bates等[16]的方法。丙二醛含量測定采用Shao等[17]的方法。

2　結果與分析

2.1逆境脅迫下 SbPRP3基因表達分析

為研究SbPRP3在大豆逆境脅迫過程中的功能，通過實時熒光定量PCR檢測大豆葉片中SbPRP3在高鹽、干旱和低溫處理下的表達情況。結果顯示(圖1)，高鹽處理后，SbPRP3表達量升高，在處理24 h達到最大值，是對照的12倍。PEG8000模擬干旱處理后，SbPRP3表達量在1 h迅速升高，是對照的13倍，之后又迅速下降并一直低于對照。低溫處理后，SbPRP3表達量在1 h達到最高，是對照的35倍，之后逐漸降低，到24 h表達量已恢復到對照水平。

圖1　SbPRP3在逆境處理下的表達Fig. 1　Expression of SbPRP3 with different stress treatments

2.2植物表達載體的構建

通過RT-PCR從大豆葉片中擴增出273 bp的SbPRP3基因全序列(圖2)。將SbPRP3構建到植物表達載體pRI101-AN上，經質粒雙酶切鑒定(圖2)，酶切條帶與期望值一致，說明目的基因已整合進植物表達載體中。將陽性質粒轉化農桿菌EHA105即獲得轉基因工程菌。

2.3轉基因煙草的篩選

取無菌條件下培養的煙草葉片進行遺傳轉化。待抗性芽生長至1 cm左右時(圖3，A)，將其從愈傷組織中分離并轉到生根培養基中。約4～5周抗性芽長出根系并逐漸成苗(圖3，B、C)。經RT-PCR檢測(圖4)，共獲得SbPRP3陽性轉基因煙草3株。

2.4轉基因煙草耐鹽性鑒定

脯氨酸測定結果顯示(圖5，A)，正常條件下，野生型煙草和轉基因煙草脯氨酸含量沒有顯著差別。當鹽脅迫處理5 h時，野生型煙草和轉基因煙草脯氨酸含量都明顯升高，但轉基因煙草脯氨酸含量極顯著高于野生型煙草；丙二醛測定結果顯示(圖5，B)，正常條件下，野生型煙草和轉基因煙草丙二醛含量沒有顯著差別。當鹽脅迫處理5 h時，野生型煙草和轉基因煙草丙二醛含量都有所升高，但轉基因煙草丙二醛含量顯著低于野生型煙草。以上結果表明SbPRP3可以提高轉基因煙草植株在高鹽脅迫下脯氨酸的積累，降低丙二醛的產生，提高煙草耐鹽性。

M. DL2000; 1. SbPRP3 PCR擴增產物; 2. SbPRP3質粒雙酶切圖2　SbPRP3 PCR擴增和質粒雙酶切結果M. DL2000; 1. PCR products of SbPRP3; 2. Products of SbPRP3 plasmid double digestionFig. 2　PCR products and plasmid double digestion of SbPRP3

圖3　SbPRP3轉基因煙草植株篩選Fig. 3　Screening of SbPRP3 transgenic tobacco

M. DL2000; 1、5. 野生型煙草; 2～4. 轉基因煙草; 6. 陽性質粒圖4　SbPRP3轉基因煙草的RT-PCR檢測結果M. DL2000; 1,5. Wild type tobacco; 2-4. Transgenic tobacco; 6. Positive plasmidFig. 4　RT-PCR detection resu1ts of SbPRP3 transgenic tobacco

WT. 野生型煙草; **和*分別表示在1%和5%概率水平上差異顯著; 下同圖5　SbPRP3轉基因煙草鹽處理5 h的葉片脯氨酸和丙二醛含量WT. Wild type tobacco; ** and * indicate significant difference at P < 0.01 and P < 0.05 respectively; The same as belowFig. 5　Proline and malondialdehyde contents of SbPRP3 transgenic tobacco plants after salt treatment for 5 h

2.5轉基因煙草耐旱性比較

脯氨酸測定結果顯示(圖6，A)，當停止澆水10 d時，野生型煙草和轉基因煙草脯氨酸含量都明顯升高，轉基因煙草脯氨酸含量與野生型煙草沒有顯著差異；丙二醛測定結果顯示(圖6，B)，當停止澆水10 d時，野生型煙草和轉基因煙草丙二醛含量都明顯升高，轉基因煙草丙二醛含量與野生型煙草沒有顯著差異。以上結果表明SbPRP3對轉基因煙草耐旱性沒有顯著影響。

圖6　SbPRP3轉基因煙草干旱處理10 d的葉片脯氨酸和丙二醛含量Fig. 6　Proline and malondialdehyde contents of SbPRP3 transgenic tobacco plants after drought treatment for 10 d

2.6轉基因煙草耐寒性比較

脯氨酸測定結果顯示(圖7，A)，當低溫脅迫處理12 h時，野生型煙草和轉基因煙草脯氨酸含量都明顯升高，但轉基因煙草脯氨酸含量顯著高于野生型煙草；丙二醛測定結果顯示(圖7，B)，當低溫脅迫處理12 h時，野生型煙草和轉基因煙草丙二醛含量都有所升高，但轉基因煙草丙二醛含量顯著低于野生型煙草。以上結果表明SbPRP3可以提高轉基因煙草植株在低溫脅迫下脯氨酸的積累，降低丙二醛的產生，提高煙草耐寒性。

3　討　論

植物細胞壁直接與外界接觸，一旦植物遭受逆境時，首先需要細胞壁的一系列變化適應這些不利環境，因此可以預見植物細胞壁蛋白可能在植物抗逆中發揮重要作用。研究表明，PRPs基因的過量表達能夠提高植物葉片的木質化程度，使細胞壁變厚，因而在細胞壁的建造和細胞的防御過程中發揮重要作用[18-19]。Deutch等認為，PRPs可能通過蛋白的雙功能域在細胞壁和膜之間起牢固的連接作用，來確保細胞的完整性，從而提高植物抗性[9, 20]。例如，水稻細胞壁蛋白OsPRP3基因的超表達可以提高轉基因水稻的抗冷性[21]；木豆CcHyPRP基因在擬南芥中超表達可以提高擬南芥的對干旱、高鹽和高溫的抵抗能力[22]。相反，將擬南芥中編碼HyPRP的EARLI1基因敲除后，突變植株的細胞在冷脅迫下更易受到破壞[23]。同樣將擬南芥中的另一個編碼PRP的SICKLE(SIC)基因敲除后，突變植株與正常擬南芥相比對冷和鹽脅迫更加敏感[24]。

本研究對大豆中較早克隆的細胞壁脯氨酸富集蛋白基因SbPRP3進行逆境處理表達分析，結果顯示高鹽、干旱和低溫處理均能不同程度地誘導SbPRP3的表達，但響應模式不完全一致。高鹽處理24 h內SbPRP3的表達量一直升高，而干旱和低溫處理后，SbPRP3的表達量先升高后降低。前人也有類似的研究結果，油菜BnPRP基因能夠被低溫誘導表達，而干旱、高溫和傷害則不影響其表達[9]。擬南芥中的PRP4、PRP11和PRP16能夠被線蟲感染誘導表達，而PRP9和PRP10則能夠被假單胞菌侵染所誘導[25]。大豆SbPRP基因能夠被干旱和鹽脅迫誘導表達，而脫落酸、激動素和茉莉酸甲酯則抑制其表達[10]。由此推測SbPRP3可能在大豆應對不同的脅迫過程中發揮不同的作用。

鑒于SbPRP3可能在大豆應對非生物脅迫時發揮功能，我們將其導入煙草中并對相關逆境生理指標進行檢測。保持水分、維持滲透調節、降低植株細胞膜損傷是植物抵抗非生物脅迫的幾個關鍵因素。本研究表明SbPRP3在轉基因煙草中通過提高滲透調節物質脯氨酸的含量以及降低細胞膜的損傷可以提高轉基因煙草的耐鹽性和耐寒性，但對轉基因煙草的耐旱性沒有顯著影響。這可能與SbPRP3對不同脅迫的響應模式不一致有關，因為模擬干旱處理后，SbPRP3的表達量僅在1 h時高于對照，之后一直低于對照。正如前人所說，某些條件下脅迫基因表達水平的上調可能不足以提高對脅迫的抗性[26]。本研究結果為進一步深入探討大豆細胞壁結構蛋白中脯氨酸富集蛋白的抗逆機制及應用奠定了良好基礎。

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(編輯:宋亞珍)

Expression ofSbPRP3 in Soybean and Resistance Ability in Transgenic Tobacco to Abiotic Stress

ZHAI Ying1, ZHANG Jun2, YANG Xiaojie1, ZHAO Yan1, CHEN Yang1

(1 College of Life Science and Agro-Forestry, Qiqihar Univesity, Qiqihar, Heilongjiang 161006, China; 2 Heilongjiang Institute of Veterinary Science, Qiqihar, Heilongjiang 161005, China)

Plant proline-rich proteins (PRPs) are putative cell wall proteins, which are usually associated with different abiotic stresses. The expression ofSbPRP3 under abiotic stress treatments in soybean was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The expression ofSbPRP3 increased under salt treatment, while it increased firstly and thereafter declined under drought and cold treatments. Furthermore，the ORF ofSbPRP3 was cloned into the plant expression vector of pRI101-AN and then introduced into tobacco by Agrobacterium-mediated transformation. Three positive transgenic tobacco plants were obtained. The transgenic tobacco plants were treated with salt, drought and cold stresses. The results showed that the transgenic plants maintained higher levels of proline and lower level of malondialdehyde compared to wild-type plants under salt and cold stresses. While the levels of proline and malondialdehyde in transgenic plants had no significant differences compared to wild-type plants under drought stress. These data indicated that the transgenic tobacco plants constitutively expressingSbPRP3 showed an increased tolerance to salt and cold compared to wild-type plants.

soybean; proline-rich protein;SbPRP3; expression analysis; stress tolerance

1000-4025(2016)07-1331-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1331

2016-04-04;修改稿收到日期:2016-05-16

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12541889)

翟瑩(1982-)，女，博士，講師，主要從事大豆分子育種研究。E-mail：fairy39809079@126.com

Q785;Q786

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