中國野生葡萄葉綠體分離及葉綠體DNA提取的研究

謝海坤，焦　健，樊秀彩，張　穎，姜建福，孫海生，劉崇懷

(中國農業科學院鄭州果樹研究所，鄭州450009)

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中國野生葡萄葉綠體分離及葉綠體DNA提取的研究

謝海坤，焦健，樊秀彩，張穎，姜建福，孫海生，劉崇懷*

(中國農業科學院鄭州果樹研究所，鄭州450009)

以中國野生刺葡萄、山葡萄、桑葉葡萄和東南葡萄的成熟葉片為材料，比較柱式植物葉綠體DNAout試劑盒和改良的高鹽-低pH法分離葉綠體及提取cpDNA效果。結果顯示：(1)2種方法均分離得到了中國野生葡萄的葉綠體，但與柱式植物葉綠體DNAout試劑盒相比，改良的高鹽-低pH法得到的葉綠體濃度高、雜質少，更適合中國野生葡萄葉綠體分離。(2)柱式植物葉綠體DNAout試劑盒提取的cpDNA，其OD260/OD280在1.28～1.36之間，質量濃度為4.2～7.8 ng·μL-1，質量低，不能滿足后續測序要求；而改良的高鹽-低pH法提取的cpDNA，其OD260/OD280值在1.84～1.90之間，質量濃度為2 514.4～4 133.7 ng·μL-1，質量高，純度好，能滿足后續測序要求。研究表明，改良的高鹽-低pH法能簡便、快速獲得中國野生葡萄完整葉綠體及高質量cpDNA，并且提取的cpDNA可滿足后續測序要求，為葡萄屬植物葉綠體基因組的深入研究奠定了基礎。

中國野生葡萄；葉綠體分離；cpDNA提取；柱式植物葉綠體DNAout；改良的高鹽-低pH法

葉綠體是植物進行光合作用的重要細胞器，具有相對獨立的遺傳物質(cpDNA)。cpDNA一般長120 160 kb[1]，多數是共價閉合雙鏈分子，少數為線狀分子。葉綠體基因組由4部分組成，大單拷貝區(LSC)、小單拷貝區(SSC)和2個反向重復序列(IRs)。葉綠體基因組序列高度保守，且屬于母系遺傳，后代遺傳穩定，已在遺傳結構分析[2]、分子標記[3]、核質互作和葉綠體基因工程[4]、起源演化[5]等領域開展了廣泛研究。

常用的植物葉綠體的分離及cpDNA提取的方法主要有DNaseI法[6]、無水法[7]、蔗糖密度梯度離心法[8]、Percoll密度梯度離心法[9]、氯化銫密度梯度離心法[10]和改良的高鹽-低pH法[11]。DNaseI法難以使葉綠體膜保持完整，導致cpDNA的得率很低[11]。無水法的報道相對較少，目前只應用在C4植物黍子[12]等植物葉綠體的分離上。傳統的密度梯度離心法主要用于提取豆科和禾本科植物的cpDNA，其成本高、耗時長、產率低，對設備要求也較高，不宜廣泛應用[13]。而改良的高鹽-低pH法，可以簡單、快速獲得完整葉綠體和高質量cpDNA，目前已成功在楊樹[14]、雷蒙德氏棉[15]、小麥[16]、茶樹[17]、棗[18]、割手密[19]等植物中得到驗證。

野生葡萄葉片內富含色素和單寧類物質，在采用常規的植物葉綠體分離及cpDNA提取方法時，會產生大量泡沫或沉淀，影響分離及提取效果。1994年，吳俊輝等[20]采用蔗糖密度梯度離心法，對幾種中國野生葡萄的葉綠體進行了研究，克服了色素和單寧等對葉綠體分離的影響，成功提取和純化了葉綠體及其DNA。但是，此方法耗時長、操作繁瑣、對設備要求也高，不易廣泛應用。而改良的高鹽-低pH法[11]結合了蔗糖密度梯度離心法、DNaseI法和鹽沉淀法的優點，結果表明，它可以簡便、快速地獲得完整葉綠體及高質量cpDNA，已廣泛應用在其他被子植物中。本研究將此方法應用于中國野生葡萄葉綠體分離及cpDNA提取，同時與柱式植物葉綠體DNAout試劑盒提取方法比較，探尋一個簡便、快速獲得中國野生葡萄完整葉綠體及高質量cpDNA的方法，為葡萄屬植物葉綠體的分離及其DNA的提取提供方法指導，這對葡萄屬植物葉綠體基因組的深入研究有重大意義。

1　材料和方法

1.1實驗材料

中國野生刺葡萄(Vitisdavidii)、山葡萄(V.amurensis)、桑葉葡萄(V.heyneana)和東南葡萄(V.chunganensis)的成熟葉片采自中國農業科學院鄭州果樹研究所國家果樹種質，鄭州葡萄圃。2015年5月摘取成熟健康的葡萄葉片，帶回實驗室，經蒸餾水洗凈，用濾紙吸干水分，并用濕潤的紗布包裹。處理后的葉片于4 ℃冰箱黑暗處饑餓處理24 h，然后液氮速凍處理，存于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2方法

1.2.1葉綠體的分離和cpDNA提取柱式植物葉綠體DNAout試劑盒(CAT#: 120406-15)購自北京天恩澤基因科技有限公司，所有步驟均按照此試劑盒的使用說明書操作。

改良高鹽-低pH法參考Shi等[11]的方法，略調整。所有操作均在冰上進行，所用玻璃器皿要事先預冷。

葉綠體的分離步驟如下：

(1)勻漿：取饑餓處理的中國野生葡萄葉片20 g，去粗葉脈，剪成1 cm長短，裝入預冷的九陽料理機(JYL-C012)中，迅速加入預冷的Buffer A[(1.25 mol/L NaCl，0.25 mol/L抗壞血酸，10 mmol/L焦亞硫酸鈉，0.012 5 mol/L 硼砂，50mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，7 mmol/L Na2EDTA(pH 8.0)，1% PVP-K40即聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，0.1%BSA即牛血清蛋白(w/v)，1 mmol/L DTT即二硫蘇糖醇(BSA和DTT現用現加，pH 3.8)]400 mL，勻漿過程盡量避免發熱，先低速勻漿2次，每次5 s，后高速勻漿57次，每次10 s，最終使材料勻漿完全。

(2)過濾：用200目單層尼龍網過濾勻漿液至預冷的500 mL量筒中，再等分到6個預冷的50 mL塑料離心管中，靜置2 min。

(3)棄細胞殘骸：4 ℃、180 g(原文獻中200 g)，離心20 min，取上清；重復離心1次。

(4)粗提：4 ℃、3 070 g(原文獻中3 500 g)，離心20 min，棄上清。

(5)純化：每管沉淀中加入42 mL預冷的Buffer B[1.25 mol/L NaCl，0.012 5 mol/L硼砂，1% PVP-K40(w/v)，50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，25 mmol/L Na2EDTA (pH 8.0)，0.1%BSA(w/v)，1mmol/L DTT(BSA和DTT現用現加)，pH 8.0]，用大小適中的無菌軟毛刷輕輕洗刷，使沉淀充分懸浮；4 ℃、3 070 g(原文獻中3 500 g)，離心20 min，棄上清。

(6)再純化：再次向每管沉淀中加入42 mL Buffer B，用無菌軟毛刷使沉淀輕輕懸浮，4 ℃、3 300 g，離心20 min，棄上清。管中即為所得葉綠體沉淀，此步驟是新增的。

(7)重復上步操作1次。隨后，用顯微鏡觀察葉綠體的完整性。

葉綠體的裂解和cpDNA提取步驟如下：在6管純化的葉綠體沉淀中均加入2 mL Buffer B，并合為一管，在4 ℃、3 300 g(原文獻中3 750 g)，離心20 min，棄上清。再向葉綠體沉淀中加入8 mL Buffer C[100 mmol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，50 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L DTT(DTT現用現加)]、1.5 mL 20% SDS、20 μL β-巰基乙醇、30 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，充分混勻，55 ℃水浴鍋中培養過夜，使葉綠體充分裂解，釋放出cpDNA。

裂解結束后，將裂解液冰浴5 min，后加入1.5 mL KAc(pH 5.7)，顛倒混勻，再冰浴30 min；4℃、5 260 g(原文獻中10 000 g)，離心15 min，用移液槍吸上清。加入與上清等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，每次需充分顛倒混勻，4 ℃、5 260 g(原文獻中10 000 g)，離心20 min。離心后的液體包括上層水相、中層變性蛋白和下層的有機溶劑。小心移取上清液至新的50 mL離心管中，加入等體積預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃過夜沉淀cpDNA。

4 ℃、5 260 g(原文獻中10 000 g)，離心20 min，棄上清，得到cpDNA。用彎鉤針頭將沉淀挑出，置于2 mL離心管中。cpDNA用預冷的70%乙醇、無水乙醇洗滌。自然風干沉淀，加入50 μL 1×TE Buffer(pH 8.0)，4 ℃溶解過夜，輕輕混勻后，即得到cpDNA原液。

加0.5 μL RNase A(去Dnase，10 mg/mL)處理cpDNA原液，37 ℃溫育30 min，自然冷卻后，得到cpDNA溶液，置于-20 ℃保存備用。

1.2.2葉綠體顯微觀察取2 mL Buffer B溶液加入提取的葉綠體沉淀中，制作臨時裝片，在尼康顯微鏡(ECLIPSE Ti-S/L100型)100×油鏡下觀察葉綠體的狀況。

1.2.3中國野生葡萄cpDNA質量檢測從提取的cpDNA溶液中取2 μL，在核酸蛋白檢測儀(美國Thermo公司，ND-1000型)上測定核酸含量，用1×TE Buffer(pH 8.0)作空白對照，記錄OD260/OD280、OD260/OD230及質量濃度。

1.2.4中國野生葡萄cpDNA電泳檢測取2 μL cpDNA溶液，加2 μL稀釋10×的熒光染料和1 μL 6×loading buffer(上樣緩沖液)混勻，在0.7%(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，恒壓126 V，恒流120 mA，電泳大約60 min后，在紫外凝膠成像分析儀(Carestream公司，GL212PRO型)下檢測其條帶情況，并拍照。

2　結果與分析

2.1中國野生葡萄葉綠體顯微觀察

采用柱式植物葉綠體DNAout(方法Ⅰ)和改良高鹽-低pH法(方法Ⅱ)，分別分離得到了刺葡萄、山葡萄、桑葉葡萄和東南葡萄的葉綠體(圖1)。對比發現，方法Ⅱ得到的葉綠體濃度高、數量多、雜質少、背景清晰，更適宜中國野生葡萄葉綠體的分離。

2.2中國野生葡萄cpDNA質量檢測

從中國野生葡萄cpDNA的OD260/OD280、OD260/OD230和質量濃度參數(表1)可以看出，2種方法得到的cpDNA各種指標差異顯著。方法I提取的cpDNA質量濃度在4.2～7.8 ng·μL-1之間，OD260/OD280值在1.28～1.36之間，低于純凈DNA的比值1.8～2.0，而OD260/OD230值在0.44～0.67之間，低于污染物的評估值2.0，這表明樣品中含有較多的蛋白質、酚類及多糖，cpDNA斷裂嚴重，純度很低，不能滿足后續的建庫測序要求。而方法Ⅱ提取的cpDNA，質量濃度高達2 514.4～4 133.7 ng·μL-1，OD260/OD280值在1.84～1.90之間，居純凈DNA的比值1.8～2.0之間，OD260/OD230值為在2.07～2.14之間，大于污染物的評估值2.0，說明多糖、蛋白質、碳水化合物的污染輕，可以滿足建庫測序要求。因此，方法Ⅱ提取的中國野生葡萄cpDNA的各種指標顯著高于方法Ⅰ。由上述可知，改良的高鹽-低pH方法所提取的cpDNA更能滿足測序要求，此方法更適合葡萄屬植物cpDNA提取。

圖1　柱式植物葉綠體DNAout(Ⅰ)和改良高鹽-低pH法(Ⅱ)分離幾種野生葡萄葉綠體顯微圖片Fig. 1　Chloroplast micrographs of 4 grapes species seperated by column plant chloroplast DNAout(Ⅰ)and modified high-salt low-pH method(Ⅱ)

2.3中國野生葡萄cpDNA電泳檢測

從瓊脂糖凝膠電泳結果(圖2)可以看出：方法I提取的cpDNA無條帶，而方法Ⅱ提取的cpDNA主帶清晰、明亮、整齊一致，無降解現象，且無RNA、多糖及其他次生物等雜質的干擾。對比可知，方法Ⅱ所得cpDNA的質量顯著好于方法Ⅰ，與核酸蛋白檢測儀分析結果相一致。

3　討　論

高質量cpDNA是葉綠體基因組測序的基礎。相對于全基因組DNA的提取，cpDNA的提取難度更大，因為葉綠體的分離較為困難，并且存在核DNA和線粒體DNA的污染。要提取高質量的cpDNA，首先要分離得到完整的葉綠體，并進行純化。此外，葉綠體的裂解和cpDNA 的提取也需要精細操作。

表1　2種方法提取的cpDNA紫外分析結果

注：Ⅰ、Ⅱ分別對應柱式植物葉綠體DNAout和改良的高鹽-低pH方法

Note: Ⅰ and Ⅱ stand for the column plant chloroplast DNAout and the modified high-salt low-pH method

圖2　柱式植物葉綠體DNAout(Ⅰ)和高鹽-低pH法(Ⅱ)提取幾種葡萄cpDNA電泳圖譜Fig. 2　Electrophoresis pattern of cpDNA of 4 grapesextracted by column plant chloroplast DNAout(Ⅰ)and modified high-salt low-pH method(Ⅱ)

目前市場上還沒有針對分離葡萄葉綠體及提取其DNA的試劑盒，本實驗所用的柱式植物葉綠體DNAout試劑盒主要是針對大豆、菠菜、煙草等一年生草本植物。從提取結果上看柱式植物葉綠體DNAout試劑盒不適合中國野生葡萄葉綠體的分離和cpDNA的提取，而改良的高鹽-低pH法卻能簡便、

快速獲得中國野生葡萄完整葉綠體及高質量葉綠體cpDNA。這可能是因為改良的高鹽-低pH法的緩沖液中，不僅含有大量的NaCl，使細胞和葉綠體膜有充足的韌性經受離心、洗滌等操作，而且緩沖液中的維生素C、焦亞硫酸鈉、BSA和DTT等還原劑能抑制溶液中的游離氧化單寧和其它次生物質呈顯色反應，從而維持勻漿液最初的顏色[20]。此緩沖液還能抑制核DNA與葉綠體之間的吸附，從而減少核DNA的污染[21]。此外，采摘葉片后的黑暗饑餓處理，充分消耗了葉片中的淀粉，減少了其對葉綠體分離和cpDNA提取的干擾[18]。

本研究在改良的高鹽-低pH法的基礎上，對離心轉速和相關步驟略微調整，成功分離出中國野生刺葡萄、山葡萄、桑葉葡萄和東南葡萄的完整葉綠體，并提取得到高質量cpDNA。改良的高鹽-低pH法分離出中國野生葡萄的葉綠體及提取的cpDNA顯著好于柱式植物葉綠體DNAout試劑盒所分離的葉綠體及提取的cpDNA，其OD260/OD280值在1.84～1.90之間，質量濃度為2 514.4～4 133.7 ng·μL-1，質量高，純度好，RNA消化完全，無降解現象，能滿足后續測序要求，為葡萄屬植物葉綠體基因組的深入研究奠定了基礎。

[1]PALMER J D. Comparative organization of chloroplast genomes [J].AnnualReviewofGenetics, 1985,19(1):325-354.

[2]陳濤,王小蓉,羅華,等.9個野生中國櫻桃群體葉綠體DNAtrnQ-rps16序列變異及其遺傳結構分析[J].遺傳,2012,34(11):1 475-1 483.

CHEN T, WANG X R, LUO H,etal. Chloroplast DNAtrnQ-rps16 variation and genetic structure of nine wild Chinese cherry (CerasuspseudocerasusLindl.) populations [J].Hereditas, 2012,34(11): 1 475-1 483.

[3]TOMOTARO N, VAUGHAN DA, KOH-LCHI K. Phylogenetic analysis ofOryzaspecies, based on simple sequence repeats and their flanking nucleotide sequences from the mitochondrial and chloroplast genomes [J].TheoreticalandAppliedGenetics, 2005,110(4): 696-705.

[4]LELIVELT C L C, MCCABE M S, NEWELL C A,etal. Stable plastid transformation in lettuce (LactucasativaL.) [J].PlantMolecularBiology, 2005,58(6): 763-774.

[5]XU D, ABE J, GAI J,etal. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans: evidence for multiple origins of cultivated soybean [J].TheoreticalandAppliedGenetics, 2002,105(5): 645-653.

[6]HALLIWELL B. Methods in Chloroplast Molecular Biology [M]. Elsevier Biomedical Press, 1982,158(1): 190-191.

[7]WU N H, COTE J C, WU R. Structure of the chloroplastpsbAgene encoding the QB protein fromOryzasativaL. [J].DevelopmentalGenetics, 1987,8(8): 339-350.

[8]HIRAI A, ISHIBASHI T, MORIKAMI A,etal. Rice chloroplast DNA: a physical map and the location of the genes for the large subunit of ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase and the 32 KD photosystem II reaction center protein [J].TheoreticalandAppliedGenetics, 1985,70(2): 117-122.

[9]HEINHORST S, GANNON G C, GALUN E,etal. Clone bank and physical and genetic map of potato chloroplast DNA [J].TheoreticalandAppliedGenetics, 1988,75(75): 244-251.

[10]胡華萃,王進,沈桂芳,等.氯化銫密度梯度離心法純化葉綠體DNA[J].浙江大學學報(理學版),1985,12(3):370-372.

HU H C, WANG J, SHEN G F,etal. Purification of chloroplast DNA by the method of CsCl-Density gradient centrifugation [J].JournalofZhejiangUniversity, 1985,12(3): 370-372.

[11]SHI C, HU N, HUANG H. An improved chloroplast DNA extraction procedure for whole plastid genome sequencing [J].PLOSOne, 2012,7(2): e31468.

[12]馬建忠,婁世慶,匡廷云,等.黍子葉綠體中存在質粒狀DNA[J].自然雜志,1992,(7):556-557.

MA J Z, LOU S Q, KUANG T Y,etal. Plastid DNA in broomcorn millet chloroplast [J].ChineseJournalofNature, 1992,(7):556-557.

[13]蓋樹鵬,孟祥棟.簡易、快速提取大蔥葉綠體、線粒體DNA的方法[J].農業生物技術學報,2000,8(3):262-262.

GAI S P, MENG X D. A simple and rapid method for the isolation of chloroplast and mitochondrial DNA from welsh onion (AlliumfistulosumL.) [J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 2000,8(3): 262-262.

[14]崔彬彬,李云,馮大領,等.楊樹葉綠體分離及葉綠體DNA提取方法研究[J].保定師范專科學校學報,2006,19(2):25-27.

CUI B B, LI Y, FENG D L,etal. A study for isolation ofPopuluschloroplast and cpDNA [J].JournalofBaodingTeachersCollege, 2006,19(2): 25-27.

[15]李鵬波,薛龍飛,王彥霞,等.雷蒙德氏棉葉綠體基因組Fosmid文庫構建[J].棉花學報,2011,23(1):10-14.

LI P B, XUE L F, WANG Y X,etal. Construction of a fosmid library of chloroplast genome inGossypiumraimondii[J].CottonScience, 2011,23(1): 10-14.

[16]侯典云,馬占強,徐虹,等.小麥葉綠體DNA提取方法研究[J].河南農業科學,2011,40(10):38-40.

HOU D Y, MA Z Q, XU H,etal. Study on extraction method of wheat chloroplast DNA [J].JournalofHenanAgriculturalSciences, 2011,20(10): 38-40.

[17]陳春梅,陳亮.茶樹葉綠體DNA 提取方法研究[J].分子植物育種,2014,12(3):562-566.

CHEN C M, CHEN L. Extraction method of chloroplast DNA of tea plant (Camelliasinensis) [J].MolecularPlantBreeding, 2014,12(3): 562-566.

[18]楊曉婷,黃建,張春梅,等.棗葉綠體基因組DNA提取方法研究[J].西北林學院學報,2015,30(2):105-110.

YANG X T, HUANG J, ZHANG C M,etal. An optimized chloroplast DNA extraction protocol for Chinese Jujube [J].JournalofNorthwestForestryUniversity, 2015,30(2): 105-110.

[19]田春艷,李富生,何麗蓮,等.割手密葉綠體DNA的高效提取方法[J].分子植物育種,2016,14(1):86-91.

TIAN C Y, LI F S, HE L L,etal. An efficient method for isolation of chloroplast DNA inSaccharumspontaneum[J].MolecularPlantBreeding, 2016,14(1): 86-91.

[20]吳俊輝,舒煦,李朝鑾.中國葡萄屬植物葉綠體DNA的提取、純化及分子量測定[J].植物分類與資源學報,1994,(2):178-186.

WU J H, SHU X, LI C L. Isolation, purification and measure of molecular weight of cpDNA fromVitisspecies in Chinese[J].ActaBotanicaYunnanica, 1994,(2): 178-186.

[21]劉少林,靖深蓉,郭立平,等.用改進的高鹽低pH法分離和純化棉花葉綠體及葉綠體DNA[J].棉花學報,1997,9(5):239-241.

LIU S L, JING S R, GUO L P,etal. A preliminary study on genetic diversity of upland cotton cultivars in China [J].CottonScience, 1997,9(5): 239-241.

(編輯:宋亞珍)

An Optimized Chloroplast Isolation and Chloroplast DNA Extraction Protocol for Chinese Wild Grapes

XIE Haikun, JIAO Jian, FAN Xiucai, ZHANG Ying, JIANG Jianfu,SUN Haisheng, LIU Chonghuai*

(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009, China)

Mature leaves collected fromVitisdavidii,V.amurensis,V.heyneanaandV.chunganensiswere used for chloroplast isolation and cpDNA extraction in this study. The two methods were the column plant chloroplast DNAout and modified high-salt low-pH method, and the results were compared with each other. (1) Both methods had separated the chloroplast of Chinese wild grapes, but the modified high-salt low-pH method obtained higher concentration and less impurity of chloroplast than that of column plant chloroplast DNAout. So the modified high-salt low-pH method was more suitable for chloroplast isolation. (2) The value of OD260/OD280of cpDNA extracted by the column plant chloroplast DNAout was between 1.28 and 1.36, and the concentration was between 4.2 ng·μL-1and 7.8 ng·μL-1, which did not meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. In contrast, the value of OD260/OD280of cpDNA extracted by the modified high-salt low-pH method was between 1.84 and 1.90 and the concentration was between 2 514.4 ng·μL-1and 4 133.7 ng·μL-1, so the cpDNA extracted in this way was extremely high-quality and pure. As a result, the cpDNA extracted by the modified high-salt low-pH method meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. As a conclusion, the modified high-salt low-pH method isolated intact chloroplast and extract high-quality cpDNA of Chinese wild grapes simply and quickly. And the cpDNA meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. It was also a critical step to make further research of chloroplast genomes ofVitisL.

Chinese wild grapes; chloroplast isolation; cpDNA extraction; column plant chloroplast DNAout; modified high-salt low-pH method

1000-4025(2016)07-1464-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1464

2016-04-19;修改稿收到日期:2016-06-04

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-30-yz-1)；中國農業科學院科技創新工程專項(CAAS-ASTIP-2015-ZFRI)；農業部物種保護項目(2130135-34)

謝海坤(1989-)，女， 在讀碩士生，主要從事葡萄種質資源研究。E-mail:1379226793@qq.com

劉崇懷，研究員，博士生導師，主要從事葡萄種質資源研究。E-mail: liuchonghuai@caas.cn

Q781; S663.1

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