Mn、Zn和Fe對醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺和麥角新堿含量的影響

萬志文，馮疆蓉，王　萍，李春杰

(蘭州大學 草地農業科技學院，草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州 730020)

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Mn、Zn和Fe對醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺和麥角新堿含量的影響

萬志文，馮疆蓉，王萍，李春杰*

(蘭州大學 草地農業科技學院，草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州 730020)

該研究通過溫室砂培試驗,考察了不同濃度Mn、Zn和Fe處理對醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺和麥角新堿含量的影響，以明確共生體產堿所需3種微量元素的最佳濃度范圍。結果表明：(1) 在短時間(3周)處理下，共生體麥角酰胺和麥角新堿含量均在Mn2+濃度為5.0 mmol·L-1時達到最大值，且顯著高于其余Mn2+濃度梯度；在較長時間(6、9 周)處理下，其麥角酰胺含量在Mn2+濃度為5.0 mmol·L-1時最大但增幅不明顯，麥角新堿在對照(0.01 mmol·L-1Mn2+)處理下積累量達到最大，且顯著高于其余處理。(2)共生體麥角酰胺含量在處理時間為3、6和9周時， Zn2+處理均在7.0 mmol·L-1下達到最大值，且處理3 周的含量顯著高于其余處理時間；其麥角新堿在3個處理時間下均于Zn2+濃度為21.0 mmol·L-1時達到最大值。(3) 在不同處理時間下，共生體麥角酰胺的含量均在Fe濃度為6.0～12.0 mmol·L-1下達到最大值，且在3 周時的含量顯著高于其余處理時間；麥角新堿含量在第3、6 周時均于Fe濃度為0 mmol·L-1下達到最大值，在第9 周時則于Fe濃度為0.03 mmol·L-1條件下達到最大值。研究認為，高濃度短時間的Mn、Zn和Fe元素處理有利于刺激醉馬草內生真菌共生體2種麥角堿的積累，可通過控制3種微量元素的濃度和共生體的生長時間來提高2種麥角堿的含量，為今后能萃取更高濃度的麥角酰胺和麥角新堿作為臨床藥劑或生物農藥提供較精確的外界條件。

醉馬草；內生真菌；麥角酰胺；麥角新堿；Mn；Zn；Fe

醉馬草(Achnatheruminebrians)是中國北方天然草地的烈性毒草之一，系禾本科芨芨草屬(Achnatherum)多年生草本植物，在新疆、青海、內蒙古、西藏、甘肅等省(區)分布較廣[1]。禾草內生真菌(fungal endophyte)是一類能夠在禾草中完成全部或大部分生命周期，但不會對宿主植物致病的一類真菌[2]。一般禾草中內生真菌主要是Epichlo? 屬及其無性階段的Neotyphodium屬，根據最新國際真菌命名法規，現統一稱為Epichlo?內生真菌[3]。自1994年美國學者Bruehl等[4]首次在采自中國新疆的醉馬草種子中發現了內生真菌，到2000年南志標和李春杰調查發現，中國甘肅省醉馬草植株的內生真菌帶菌率近乎100%[5]。據報道，內生真菌提高了醉馬草的抗旱性、耐鹽性[6]、抗蟲性[7]、抗病性[8]和對重金屬脅迫的耐受性[9-11]，而醉馬草提供了內生真菌生長發育所需的營養物質，兩者形成互惠的共生體。醉馬草內生真菌共生體可產生2種重要的麥角生物堿，即麥角酰胺和麥角新堿，這2種生物堿作為一類控制傷口血流量的藥物已被廣泛應用于臨床[12-13]。但其也是醉馬草引起家畜和食草昆蟲中毒的主要原因[14-16]。因此，麥角新堿和麥角酰胺既具有一定的藥用價值，也可作為環保綠色的生物防治農藥進一步開發利用。

植物生長發育除需要大量元素碳、氫、氧、氮、磷和鉀等以外，還需要微量元素硼、鉬、銅、鋅和鐵等。微量元素在植物體內雖然含量極少，但它是植物正常生長不可或缺的物質，對植物體內生理生化過程起著至關重要的作用。缺少微量元素后植物會出現一系列的生理病癥，比如植物缺B會出現花而不實，這是因為在缺B條件下，花粉的萌發和花粉管的生長受到了抑制，無法形成正常的果實。Mn、Zn和Fe在植物體內均參與多種酶的組成、光合作用和呼吸作用等，缺乏這3種微量元素會導致植物體內代謝受阻，葉片失綠，產量下降等。但過量的Mn、Zn和Fe會對植物產生毒害，影響植物正常生長[17-21]。

微量元素除了參與上述各種生理生化反應，還在植物體內次生產物的代謝過程中具有重要的作用。如硼和銅均能與高等植物體內類黃酮反應生成絡合物，使類黃酮在植物體內的存在更加穩定[22]。生物堿是常見的次生代謝物，其含量與生物因子(如基因型、病蟲害、食草動物、 微生物、人工干擾等)和非生物因子(如光照、溫度、土 壤、水分等)有關[23-25]。據報道，禾草內生真菌中的生物堿與大量元素有關，如 內生真菌麥角類生物堿的合成與P元素有關[26]；土壤中有效P能夠影響帶菌高羊茅中麥角生物堿的含量[27]；N和Ca也與新西蘭草甸羊茅中生物堿含量有關[28]；N、P、NP組合及色氨酸對醉馬草麥角酰胺和麥角新堿含量也有一定的促進作用[29]。但關于微量元素對麥角生物堿合成代謝影響的研究目前尚無報道。王萍等[30]對Mn、Zn和Fe脅迫下醉馬草的生長和生理指標進行了探討，但未對麥角新堿和麥角酰胺進行進一步的檢測，因此本試驗擬在不同濃度的Mn、Zn和Fe處理下考察醉馬草內生真菌共生體的產堿情況，通過高效液相色譜檢測其麥角新堿和麥角酰胺的含量變化，以明確醉馬草內生真菌共生體生物堿積累所需3種微量元素的最佳濃度范圍，為提取更高濃度的麥角酰胺和麥角新堿探索最佳條件。

1　材料和方法

1.1試驗材料

醉馬草種子于2011年采自甘肅天祝打柴溝(102°52′ E，37°12′ N)并播種于蘭州大學榆中校區，2012年10月收獲的種子5℃保存于農業部牧草與草坪草種子質量監督檢驗中心(蘭州)種子儲藏室，2013年3月建立帶菌(E+)和不帶菌(E-)醉馬草小區，2014年7月將收獲的醉馬草種子用于本試驗。3種微量金屬元素分別以MnCl24·H2O、ZnSO4·7H2O和Fe·citrate·3H2O分析純試劑的形式添加。

1.2材料培養與處理

挑選籽粒飽滿、表面健康的帶菌醉馬草種子于2裝有300 g混合培養基質的(蛭石∶珍珠巖=3∶1)聚乙烯花盆(口徑15 cm，底徑10 cm，深12 cm)中，在蘭州大學榆中校區智能溫室條件下[光周期12 h光照，溫度(20±1) ℃，光照強度120 μmol·m-2·s-1]進行培養。每周定量澆灌300 mL Hoagland營養液。待醉馬草幼苗生長到第4周齡后開始處理，處理液元素種類和處理水平見表1。Mn和Zn元素濃度梯度的設置參考蘇加義等[31]的方法，Fe元素濃度梯度的設置參考高大文等[32]的方法。以澆灌完全營養液作為對照，其他各濃度梯度作為處理，每個濃度梯度(共計5個濃度梯度)3次重復。每周澆灌蒸餾水和處理液各1次，每次澆灌量為300 mL。試驗各處理梯度采取完全隨機區組擺放。在處理第3周、6周和9周后對醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺和麥角新堿含量進行測定。

1.3醉馬草內生真菌共生體幼苗麥角生物堿的提取及其含量的測定

將待測醉馬草幼苗在-20 ℃的冰箱冰凍5 h，并在冷凍干燥機中-60 ℃干燥24 h后，取出速于研缽中研磨成粉末。稱取50 mg樣品裝于1.5 mL的eppendorf離心管中；加入1 mL提取液(CHCl3∶MeOH∶NH4OH=75∶25∶2), 顛倒混勻，室溫黑暗條件下過夜。 后經15 ℃、10 000 r·min-1條件下離心5 min，于通風廚中黑暗條件下自然揮發干燥。每個離心管加入0.75 mL MeOH∶CCl4(1∶2)和0.25 mL 25 mmol·L-1酒石酸，顛倒混勻后，于離心機(Beckman, Germany)中在21 ℃、12 000 r·min-1條件下離心5 min，吸取上清液0.25 mL經0.22 μm孔徑的有機相過濾塾過濾至1.5 mL棕色色譜瓶，待用[33]。用Agilent 1 100 series高效液相色譜系統，ZORBAX-XDB C18色譜柱，流動相流速1 mL·min-1進行檢測。流動相A為0.1 mol·L-1NH4OAc，B為乙腈/0.1 mol·L-1NH4OAc(3/1)。按照95% A液3 min、70% A液22 min、65% A液5 min、95% A液10 min流動相配比與時間，檢測波長312 nm，發射波長427 nm[34]。

1.4數據處理

所有數據均用Excel錄入，并作圖。采用SPSS 16.0統計軟件進行差異顯著性分析，用Duncan法進行多重比較。

2　結果與分析

2.1Mn處理對醉馬草內生真菌共生體麥角生物堿含量的影響

2.1.1麥角酰胺含量隨著處理時間的延長，醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺含量在不同濃度的Mn2+處理條件下均呈先降低后增加的趨勢，并均在處理第3 周時達到最大值，且大多顯著(P<0.05)高于其余處理時間(表2)。在相同處理時間內，共生體麥角酰胺含量隨著Mn2+處理濃度的升高先增加后降低，且各處理時間均在Mn2+處理濃度為5.0 mmol·L-1時達到最大值，分別比對照(CK)增加了43.8%、26.5%和8.1%，而其它各個處理均與對照無顯著性差異(P>0.05)。

2.1.2麥角新堿含量由表2可知，隨著處理時間的增加，醉馬草內生真菌共生體麥角新堿含量在對照和0.0 mmol·L-1Mn2+處理下呈逐漸增加的趨勢，在處理第9 周時達到最大值，此時分別是處理第3 周時的10.06倍和2.76倍(P<0.05)；在2.5 mmol·L-1Mn2+處理下，共生體麥角新堿含量隨著時間的延長呈緩慢下降趨勢，但沒有顯著變化(P>0.05)；在5.0和7.5 mmol·L-1Mn2+處理下，共生體麥角新堿含量隨著處理時間的增加呈先降低后上升的趨勢，但仍以處理3周時顯著較高。在處理第3周時，共生體麥角新堿含量以5.0 mmol·L-1Mn2+處理最高，且顯著高于其余Mn2+濃度梯度(P<0.05)，是對照的4.53倍；而在處理第6、9周時，共生體麥角新堿含量均在對照下達到最大值，且顯著高于其余處理(P<0.05)。

以上結果說明，較高濃度的Mn2+對醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺的積累具有一定的促進作用，且在短時間內效果更好；同樣，短時間的高濃度Mn2+處理可以刺激共生體產生麥角新堿，而長時間的高濃度處理則不利于麥角新堿的積累。

表1　盆栽試驗處理元素種類和處理水平[28]

表2　不同Mn處理下醉馬草幼苗麥角酰胺和麥角新堿含量的變化

注：表中數據為平均值±標準誤(n=5)；同列中的不同小寫字母表示同期處理間差異顯著(P<0.05)，而同行不同大寫字母表示處理時間之間差異顯著(P<0.05)。下同

Note: Data are present as mean ± SE(n=5); Different normal letters within the same column mean significant difference among treatments at 0.05 level, while different capital letters within the same row mean significant difference among stages at 0.05 level. The same as below.

2.2Zn2+處理對醉馬草幼苗麥角生物堿含量的影響

2.2.1麥角酰胺含量表3顯示，隨著Zn2+處理時間的延長，醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺含量在0 ～14.0 mmol·L-1Zn2+處理下呈先降低后增加的趨勢，并在處理第3 周時達到最大值，且顯著(P<0.05)高于其余處理時間；而在21.0 mmol·L-1Zn2+濃度時，共生體麥角酰胺含量呈逐漸下降的趨勢，且處理第3 周時的含量顯著(P<0.05)高于其余處理時間。在相同處理時間內，醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺含量隨著Zn2+處理濃度的升高大多呈先增加后降低的趨勢；在處理第3、6和9周時，共生體麥角酰胺含量均在7.0 mmol·L-1Zn2+處理下達到最大值，分別比對照顯著增加了84.0%、33.1%和44.5%；在處理第9 周時，21.0 mmol·L-1Zn2+濃度處理的麥角酰胺含量顯著(P<0.05)低于其余的濃度處理，與對照相比顯著減少了28.5%。

2.2.2麥角新堿含量從表3還可看出，隨著Zn2+處理時間的延長，醉馬草內生真菌共生體麥角新堿含量在不同濃度的Zn2+處理下均逐漸增加，并在處理第9 周時達到最大值，且大多顯著(P<0.05)高于其余處理時間。醉馬草內生真菌共生體麥角新堿含量在處理第3周時隨著Zn2+處理濃度的升高而增加，而在處理第6、9 周時則隨著Zn2+處理濃度增加呈先降低后升高的趨勢；在3個處理時間下，共生體麥角新堿含量均在21.0 mmol·L-1Zn2+處理下達到最大值，分別比對照增加了3.66倍、1.55倍和1.29倍。

以上結果說明，短時間內醉馬草內生真菌共生體產生麥角酰胺的最適宜Zn2+濃度為7 mmol·L-1，過高或過低濃度均會對其產生不利影響，而長時間內Zn2+處理對麥角酰胺的積累效果不佳；但是，長時間高濃度的Zn2+處理有利于共生體麥角新堿的積累。

2.3Fe處理對醉馬草幼苗麥角生物堿含量的影響

2.3.1麥角酰胺含量隨著Fe處理時間的延長，醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺含量在不同濃度的Fe處理下呈先降低后增加的趨勢，并均在處理第3 周時達到最大值，并大多顯著高于其余處理時間(表4)。在相同處理時間內，共生體麥角酰胺含量隨著Fe處理濃度的升高呈先增加后降低的趨勢；在處理第3、6 周時，共生體麥角酰胺的含量均在Fe濃度為6.0～12.0 mmol·L-1下達到最大值，分別比對照顯著增加了大約109.3%和204.2%；在處理第9 周時，共生體麥角酰胺含量在Fe濃度為6.0 mmol·L-1處理下達到最大值，與同期對照相比顯著增加了113.9%。

表3　不同Zn處理下醉馬草幼苗麥角酰胺和麥角新堿含量的變化

表4　不同Fe處理下醉馬草幼苗麥角酰胺和麥角新堿含量的變化

2.3.2麥角新堿含量表4顯示，隨著處理時間的延長，醉馬草內生真菌共生體麥角新堿含量在對照組表現為逐漸增加，而在其他Fe濃度處理下均表現為先增加后減小的趨勢，各濃度處理第3周的含量均明顯低于第6、9周。在處理第3、6 周時，共生體麥角新堿含量均在Fe濃度為0 mmol·L-1處理下達到最大值，與對照相比分別顯著增加了5.52和2.13倍；而在處理第9 周時，麥角新堿含量在Fe濃度為0.03 mmol·L-1條件(CK)下達到最大值。

從以上分析結果可知，短時間高濃度的Fe對醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺的產生具有較強促進作用；而共生體麥角新堿產生對于Fe的需求量較少，但長時間的生長需要補充一定量Fe元素。

3　討　論

麥角堿生物合成首先是合成麥角靈環。由乙酰輔酶A生成的甲戊二羥酸(MVA)是生物堿合成的起始物，進而形成焦磷酸二甲烯丙酯，在二甲烯丙基色氨酸合酶催化下與L-色氨酸發生環合得到二甲烯丙基色氨酸(DMAT)。DMAT在甲基轉移酶催化下發生N-甲基化，之后脫羧并環合形成裸麥角堿，裸麥角堿為麥角靈環生物合成的起始物質[27,35]。而二甲烯丙基色氨酸合酶(dimethylallytrytophan synthase，DMATS) 已被證明是整個麥角生物堿合成過程中的限速酶[36]，色氨酸既是共生體中麥角堿生物合成的前體也是該關鍵酶的誘導物。

早在1948年Tsui[37]發現缺Zn的番茄植株中色氨酸含量顯著下降，1951年Nason等[38]觀察到鏈孢霉在缺Zn條件下色氨酸含量減少，并且認為是由色氨酸合成酶活性下降所致。后來學者對缺Zn玉米幼苗進行代謝物測定時也發現色氨酸含量下降的現象[39-40]，Zn被證實是色氨酸合成所必需的元素。因此，Zn可以通過影響色氨酸的合成間接地影響麥角生物堿的合成。除此之外，Zn還可以通過參與醉馬草內生真菌共生體的生理生化過程影響其生長，進而影響產堿。王萍等[30]試驗表明，當Mn、Zn和Fe處理濃度低于或高于對照時，醉馬草內生真菌共生體株高、分蘗和生物量均呈下降趨勢；而隨著3種微量元素濃度的升高，脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA) 過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)含量呈上升趨勢。本試驗結果發現，不同濃度的Zn和不同處理時間對醉馬草內生真菌共生體2種麥角堿的影響也不同，短時間處理下最適宜麥角酰胺積累的Zn濃度為7 mmol·L-1，長時間Zn處理的效果不如短時間處理明顯，而長時間高濃度的Zn處理則有利于共生體麥角新堿的積累。

Mn直接參與植物光合作用中電子傳遞系統的氧化還原過程及PSⅡ系統中水的光解，并對維持葉綠體膜正常的結構有重要的作用[41]。Mn含量的多少直接影響植物的生長狀況，過量的Mn會導致葉片輸導組織壞死，蛋白質合成受阻，而Mn不足則會通過作用于光合作用等生理過程減緩生命進程[42]。本試驗研究表明，在整個Mn處理過程中，醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺的含量均在Mn濃度為5.0 mmol·L-1下達到最大值，且在短時間內增幅最大，同樣共生體麥角新堿含量在處理第3 周、Mn濃度為5.0 mmol·L-1下達到最大值，但超過3 周后，其含量在較低濃度的對照(0.01 mmol·L-1)條件下顯著高于其他Mn處理濃度，說明短時間內的較高濃度Mn對麥角新堿產生的刺激效果最佳，這可能是由于長時間的高濃度Mn處理對醉馬草內生真菌的生長有一定的抑制作用，進而影響其產堿。

Fe除了參與植物體內光合作用、氧化還原反應和電子傳遞之外，還是與氮代謝有關的固氮酶、硝酸還原酶和亞硝酸還原酶等的組成成分[43-44]。麥角生物堿是一類含氮化合物，因此，Fe既可以通過直接影響醉馬草內生真菌共生體的生長來影響其產堿，也可能直接參與麥角堿的合成。在本試驗中，當Fe的處理濃度為6.0～12.0 mmol·L-1時，最適宜醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺的積累，而麥角新堿在短時間內對Fe的需求量較少，但隨著生長時間的延長，需要適當補充一定量較低濃度(0.03 mmol·L-1)的Fe元素。

綜上所述，本研究首次在不同濃度Mn、Zn和Fe的處理下探討了醉馬草內生真菌共生體麥角酰胺和麥角新堿含量的變化規律，總體來說，高濃度短時間的 3 種微量元素處理有利于刺激2種麥角堿的積累，但其刺激醉馬草內生真菌共生體的產堿機理還有待進一步研究。

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(編輯:裴阿衛)

Ergot Alkaloids Content of Symbiont ofEpichlo?gansuensis-Achnatheruminebriansunder Different Mn, Zn and Fe Conditions

WAN Zhiwen, FENG Jiangrong, WANG Ping, LI Chunjie*

(Key Laboratory of Grassland Farming Systems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology , Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

A study was conducted to investigate the effects of different concentrations of Mn, Zn and Fe on variations of ergot alkaloids contentin symbiont ofEpichlo?gansuensis-Achnatheruminebrians. The results showed that: (1) The contents of ergine and ergonovine under Mn2+5.0 mmol·L-1had a peak value at the 3rd week，which had significant(P<0.05) difference with other Mn2+treatments, but the contents of ergonovine under 0.01 mmol·L-1had a peak value at the 6th and 9th week. (2) The contents of ergine had maximum under Zn2+7.0 mmol·L-1at the 3rd , 6th and 9th week , and the contents of ergine was significantly (P<0.05) higher at the 3rd week than those at the 6th and 9th week. (3) The contents of ergonovine had maximum under Fe2+21.0 mmol·L-1at the 3rd, 6th and 9th week. The contents of ergine had a peak value under 6.0～12.0 mmol·L-1at the 3rd, 6th and 9th week , and the contents of ergine was significantly (P<0.05) higher at the 3rd week than those at the 6th and 9th week. The contents of ergonovine had maximum under Fe2+0.0 mmol·L-1at 3rd and 6th week, but under 0.03 mmol·L-1had a peak value at 9th week. So，high concentrations of Mn, Zn and Fe elements is helpful to stimulate the drunken horse grass infected by endophytic fungi to accumulate tow ergot alkaloid for a short time treatment.

Achnatheruminebrians; endophyte; ergine; ergonovine; Mn;Zn;Fe

1000-4025(2016)07-1427-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1427

2016-04-11;修改稿收到日期:2016-06-06

國家“973”項目(2014CB138702)；國家自然科學基金(31372366)；教育部創新團隊發展計劃(IRT13019)

萬志文(1992-)，女，在讀碩士研究生，主要從事禾草-內生真菌共生體研究。E-mail：wanzhw14@lzu.edu.cn

李春杰，博士，教授，主要從事禾草內生真菌共生體及草類植物病理學研究。E-mail：chunjie@lzu.edu.cn

Q945.79

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